陳德森 李 莉 吳勝英 彭吉霞 李賢玉

急性膝關(guān)節(jié)炎動物模型是基礎(chǔ)藥理學及臨床疼痛研究較常用的實驗?zāi)Ｐ停?］。以往常采用醋酸皮下注射法復制急性膝關(guān)節(jié)炎動物模型，本實驗采用弗氏完全佐劑法復制膝關(guān)節(jié)炎動物模型，其病理形態(tài)及病理生理學改變與臨床膝關(guān)節(jié)炎甚為相似，具有相似度極高的臨床及生化檢驗特點，現(xiàn)就該動物模型制作介紹如下［2］。

材料與方法

1.實驗動物:SPF 級Wistar 大鼠30 只，雌雄兼用，體質(zhì)量180 ～250 g，由湖北省實驗動物研究中心提供［SCXK(鄂)2011 -008］，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施［SYXK(鄂)2011 -0031］。

2.藥品與試劑:生理鹽水、醋酸、弗氏完全佐劑(上海實生細胞生物技術(shù)有限公司)。

3.急性膝關(guān)節(jié)炎模型制備:采用數(shù)字表法將大鼠隨機分為3 組(n=10):對照組、醋酸組、佐劑組。碘伏浸泡大鼠右足趾消毒，采用日本鬼頭康彥的造摸方法，將弗氏完全佐劑0.5ml 注人右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，于第1、3、7 天各注射1 次［3］。根據(jù)臨床上超疲勞容易提前出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病特點，每日強迫動物活動30min，14 天后出現(xiàn)以下與臨床急性膝關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)一致的癥狀即可確定大鼠急性膝關(guān)節(jié)炎模型造模成功:①關(guān)節(jié)及其周圍僵硬、活動受限;②關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛、同時軟組織腫脹或積液;③發(fā)病的部位常見于膝、髖、踝等關(guān)節(jié)處;④關(guān)節(jié)積液檢查出現(xiàn)IL-1β 降低，HA 含量明顯升高;⑤關(guān)節(jié)病理切片鏡檢出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔大量滲出液，軟骨表面粗糙，滑膜增生、粘連、肥厚等膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學改變。對照組注射等量生理鹽水作對照，醋酸組注射97%醋酸0.5ml。注射后創(chuàng)口碘伏浸泡消毒1 周(每日1 次)以預(yù)防感染。參照文獻［4］于造模后7、14 天分別抽取膝關(guān)節(jié)腔積液測定積液白細胞介素-1β(IL-1β)、透明質(zhì)酸(HA)含量。

4.動物一般狀況觀察:動物的一般狀況觀察(包括自潔情況、攝食、飲水量、活動等)，存活情況。

5.膝關(guān)節(jié)腫脹百分率的測定:于造模前及造模后7、14 天用玻璃容器排水法測量:先取直徑2cm 的30ml 量筒注入蒸餾水，液面與量筒最高處平齊，用10ml 注射器吸取量筒內(nèi)蒸餾水約5ml。于每只大鼠右膝關(guān)節(jié)做一標記，然后把大鼠右足跖緩慢伸人量筒內(nèi)，使標記與量筒最高處平齊。再用已吸入5ml水的注射器向量筒內(nèi)緩慢注入蒸餾水并使液面再次與最高處及大鼠膝關(guān)節(jié)標記一致，讀取注射器內(nèi)剩余液體體積，即為大鼠的膝關(guān)節(jié)體積，重復3 次取平均值。并計算膝關(guān)節(jié)腫脹百公率:膝關(guān)節(jié)腫脹百分率(%)= (造模后容積- 造模前容積)/造模前容積×100%。

6.組織形態(tài)學檢查:14 天后處死大鼠，迅速取各組動物膝關(guān)節(jié)滑膜標本用10%中性甲醛固定，1 周后常規(guī)脫水，石臘包埋，切片經(jīng)HE 染色，光鏡下觀察組織形態(tài)。

7.統(tǒng)計學方法:采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，指標的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異則采用Dunnett 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.大鼠一般情況的變化:對照組造模前及造模后7、14 天觀察，大鼠體毛有光澤，反應(yīng)敏捷，飲食正常，無死亡。醋酸組大鼠1 周后精神及自潔情況差，大鼠體毛發(fā)無光澤，醋酸刺激性太強引起動物劇痛舔足，關(guān)節(jié)腫脹，卷縮，拒絕活動，攝食及飲水量減少，無死亡，8 只大鼠造模成功，模型成功率為80%。佐儕組大鼠1 周后精神及自潔情況較醋酸組稍好，部分大鼠體毛無光澤，關(guān)節(jié)及其周圍僵硬、活動受限，舔足，攝食及飲水量與正常大鼠無明顯差別，無死亡，10 只大鼠均造模成功，模型成功率為100%。

2.膝關(guān)節(jié)積液中IL-1β、HA 含量:由表1 可見，對照組IL -1β、HA 無明顯變化;醋酸組在造模后7天時測得IL-1β 小幅度升高、HA 含量有降低趨勢，第14 天IL-1β 明顯高于、HA 含量低于對照組(P ＜0.05);佐儕組在造模后7 天時IL-1β 即開始明顯升高，HA 含量明顯降低，第14 天測得IL-1β 升高達峰值、HA 含量大幅降低，與術(shù)前及醋酸組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，說明弗氏完全佐劑能在更短時間促使炎性介質(zhì)IL -1β 大量分泌釋放，抑制關(guān)節(jié)保護介質(zhì)HA 的分泌，破壞HA 對關(guān)節(jié)面的保護屏障而造成膝關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)。弗氏完全佐劑組生化測定與臨床相符度高，表明弗氏完全佐劑能更好的復制急性膝關(guān)節(jié)炎。

表1 大鼠造模前及術(shù)后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)IL-1β 及HA 含量的變化(±s，n=10)

表1 大鼠造模前及術(shù)后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)IL-1β 及HA 含量的變化(±s，n=10)

與對照組比較，* P ＜0.05;與造模前比較，#P ＜0.05;與醋酸組比較，ΔP ＜0.05

組別 IL-1β(ng/ml)HA(mg/L)造模前 術(shù)后7 天 術(shù)后14 天 造模前 術(shù)后7 天 術(shù)后14天2.07 ±0.04 2.07 ±0.03醋酸組 19.19 ±0.25 24.94 ±0.27 25.54 ±0.37* 1.91 ±0.01 1.77 ±0.05 1.04 ±0.02*佐儕組 20.04 ±0.31 34.57 ±0.41* #Δ 41.47 ±0.48* #Δ 1.97 ±0.05 0.94 ±0.02* #Δ 0.73 ±0.01* #Δ對照組 18.32 ±0.24 17.91 ±0.24 18.23 ±0.23 2.01 ±0.05

3.膝關(guān)節(jié)腫脹百分率對比情況:對照組在造模后第7、14 天后關(guān)節(jié)無腫脹現(xiàn)象;醋酸組及佐劑組膝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)不同程度的腫脹，醋酸組第7、14 天后關(guān)節(jié)腫脹百分率分別為22. 07% ± 0. 05%、21. 97% ±0.24%;佐劑組分別為36.21% ±4.71%、39.34% ±3.98%;數(shù)據(jù)顯示佐劑組關(guān)節(jié)腫脹百分率高于醋酸組，其炎性反應(yīng)更加明顯(P ＜0.05)，說明弗氏完全佐劑復制急性膝關(guān)節(jié)炎動物模型更為成功(表2)。

表2 大鼠造模前及術(shù)后膝關(guān)節(jié)腫脹百分率(%)對比(±s，n=10)

表2 大鼠造模前及術(shù)后膝關(guān)節(jié)腫脹百分率(%)對比(±s，n=10)

與對照組比較，* P ＜0.05;與造模前比較，#P ＜0.05;與醋酸組比較，ΔP ＜0.05

項目 造模前術(shù)后7 天 14天0.02 ±0.00 -0.01 ±0.00 0.01 ±0.01醋酸組 -0.01 ±0.01 22.07 ±0.05* 21.97 ±0.24*佐儕組 0.01 ±0.00 36.21 ±4.71* #Δ 39.34 ±3.98* #Δ對照組

4.膝關(guān)節(jié)滑膜病理切片組織形態(tài)學檢查:對照組(圖1A)組織結(jié)構(gòu)正常，無充血、水腫和中性粒細胞浸潤。醋酸組(圖1B)滑膜呈現(xiàn)充血、水腫和中性粒細胞浸潤。而佐劑組(圖1C)關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，變暗呈灰黃色，并有裂紋、糜爛及潰瘍形成;滑膜存在不同程度增生、粘連;關(guān)節(jié)液量增多，且呈泡沫狀，滑膜血管擴張，血漿和細胞外滲，產(chǎn)生大量滲出液，滑膜肥厚、關(guān)節(jié)內(nèi)粘連和淋巴細胞和漿細胞浸潤;軟骨細胞排列不規(guī)則，基質(zhì)分布不均，表明弗氏完全佐劑致膝關(guān)節(jié)炎性反炎更為明顯。

圖1 14 天大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)觀察(HE，×40)

討 論

膝蓋滑膜炎又稱膝關(guān)節(jié)滑膜炎，是一種多發(fā)性疾病［5，6］。當膝蓋滑膜損傷后，關(guān)節(jié)腔滑膜血管擴張、充血、水腫及大量中性粒細胞浸潤，造成關(guān)節(jié)腫脹及活動受限［7］。如不及時處理，會導致滑膜絨毛水腫、結(jié)締組織纖維增生老化，造成滑膜組織再生及修復能力降低，嚴重者出現(xiàn)滑膜肥厚、關(guān)節(jié)粘連和軟骨變性等病理改變，嚴重影響患者活動。故對膝關(guān)節(jié)滑膜炎的早期診治顯得尤為重要。本研究的目的就是為尋找一種病理形態(tài)及病理生理學改變與臨床膝關(guān)節(jié)炎高度相似的動物模型用于研究膝關(guān)節(jié)滑膜炎。

關(guān)節(jié)炎的病理變化主要為軟骨的破壞與變性，以及繼發(fā)的滑膜與滑液炎性改變，是軟骨分解與合成代謝失衡的結(jié)果。正常的關(guān)節(jié)滑液中僅含有微量的IL-1β，但在膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中IL -1β 的含量則異常增高［8］。IL-1β 作為重要的炎性介質(zhì)，具有細胞破壞能力。王慶甫等［9］證明關(guān)節(jié)軟骨的破壞主要是由IL-1β 激發(fā)的。HA 是由D -葡萄糖醛酸和N -乙酰氨基葡萄糖胺二糖單位有規(guī)律重復構(gòu)成的大分子鏈狀多糖，化學本質(zhì)為糖胺多糖，廣泛分布于人及動物的結(jié)締組織、眼玻璃體和滑液中，是關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)的重要組成部分，黏附于關(guān)節(jié)軟骨表面，形成保護屏障，調(diào)整滑膜通透性，減低摩擦系數(shù)潤滑關(guān)節(jié)腔，營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨，利于關(guān)節(jié)軟骨修復［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，醋酸組在造模后第14 天測得IL -1β 明顯升高、HA 含量降低，說明炎性介質(zhì)分泌較晚;而弗氏完全佐劑組在造模后7 天即開始明顯升高，HA 含量明顯降低，第14 天測得IL-1β 升高達峰值、HA 含量顯著降低，與醋酸組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明弗氏完全佐劑能在更短時間內(nèi)促使炎性介質(zhì)IL-1β 大量分泌，抑制關(guān)節(jié)保護介質(zhì)HA 的分泌，破壞HA 對關(guān)節(jié)面的保護屏障而造成膝關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)。在造模后第7、14 天時觀察發(fā)現(xiàn)，醋酸組及弗氏完全佐劑均發(fā)生關(guān)節(jié)腫脹，但弗氏完全佐劑組膝關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)更明顯，第7、14 天兩次測得膝關(guān)節(jié)腫脹百分率明顯大于醋酸組，其模型成功率達100%，明顯優(yōu)于醋酸組的80%。

在膝關(guān)節(jié)滑膜病理切片組織形態(tài)學檢查中發(fā)現(xiàn)，弗氏完全佐劑組病理學改變較醋酸組更為嚴重，出現(xiàn)典型的膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學改變，如關(guān)節(jié)軟骨細胞排列不規(guī)則，基質(zhì)分布不均;關(guān)節(jié)表面粗糙，伴有裂紋、糜爛及潰瘍形成;滑膜存在不同程度增生、粘連;關(guān)節(jié)腔大量滲出積液并呈泡沫狀，滑膜肥厚、關(guān)節(jié)內(nèi)粘連和淋巴細胞和漿細胞浸潤等病理改變。目前急性膝關(guān)節(jié)炎動物模型大多采用關(guān)節(jié)腔注射醋酸法，但其缺點是醋酸刺激性太強，會引起動物劇痛，不太符合實驗動物倫理及動物福利規(guī)范，且其IL-1β、HA 分泌釋放改變比弗氏完全佐劑法出現(xiàn)的晚，病理改變亦不如弗氏完全佐劑典型［11］。本實驗研究證實，大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射弗氏完全佐劑第7 天后IL -1β 釋放即明顯升高、HA 顯著降低，具有典型的膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學改變，且這種病理改變較醋酸組更為明顯，模型成功率高，IL-1β、HA 分泌改變出現(xiàn)早，動物疼痛幅度低，更符合實驗動物倫理及動物福利規(guī)范要求，不失為一種較理想可靠的急性膝關(guān)節(jié)炎動物模型造模方法［12］。

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