楊 婷 崔麗英

支氣管哮喘是一種有明顯家族聚集傾向的多基因遺傳病，Moffatt 等［1］于2007 年首次通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)性研究(genome-wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)位于17 號(hào)染色體之上的ORMDL3 (oresomueoid 1 -like protein 3)基因與兒童期哮喘密切相關(guān)。其中位于 ORMDL3 附近的 GSDML 基因上的SNPrs7216389 的與哮喘的相關(guān)性研究已在多個(gè)種族、地區(qū)中廣泛開(kāi)展。近3 年來(lái)我國(guó)同類(lèi)相關(guān)研究相繼增多，曾在北京兒童、南方成人等不同年齡組，漢族、海南黎族等不同民族，江西省、山東省、深圳市等不同地域利用全基因組關(guān)聯(lián)性研究、PCR 產(chǎn)物酶切等方法探討ORMDL3 基因多態(tài)性，尤其是rs7216389與哮喘的關(guān)系［2～7］。目前在我國(guó)北方少數(shù)民族聚集地區(qū)，如內(nèi)蒙古自治區(qū)的蒙古族人群中關(guān)于ORMDL3基因多態(tài)性與成人哮喘的關(guān)聯(lián)性研究并不多見(jiàn)。本研究嘗試探討該基因與蒙古族哮喘是否相關(guān)。

資料與方法

1.資料:選擇2011 年8 月～2013 年2 月間就診內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，符合3 代及以上直系親屬均為蒙古族血統(tǒng)的成人哮喘確診患者100 例(哮喘組)，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組在2008 年制訂的支氣管哮喘防治指南［8］，剔除了患有其他慢性呼吸系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病及其他器質(zhì)性疾病者。男性49 例，女性51 例，患者年齡16 ～70 歲，平均年齡45.00 ±13.64 歲;對(duì)照組:健康蒙古族成人100 例，其中男性53 例，女性47 例，患者年齡18 ～67 歲，平均年齡44.66 ±12.78 歲。研究對(duì)象年齡、性別構(gòu)成比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，進(jìn)行研究前均取得受試者知情同意。

2.研究方法:(1)DNA 提取及檢測(cè)純度:用EDTA 管抽取外周靜脈血2ml，利用血液基因組提取試劑盒(北京天根生物試劑公司)提取DNA，通過(guò)紫外分光光度儀(MJ -Research，Inc，美國(guó))檢測(cè)其純度。(2)DNA 擴(kuò)增:通過(guò)Primer Premier 軟件設(shè)計(jì)目的SNPrs7216389 的引物，序列如下:上游引物:5' -TCTCTCGCTGTTGTTTGTAT-3'，下游引物:5' -CCCTGTAGGTTCCCATCT- 3'，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，PCR 擴(kuò) 增 反 應(yīng) 體 系(50μl):2 × Taq Master Mix(25μl)、ORMDL3 -F(1.0μl)、ORMDL3 -R(1.0μl)、dNTP (1.0μl)、滅菌無(wú)離子水(22μl)，擴(kuò)增產(chǎn)物443bp，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，循環(huán)25次，72℃過(guò)延伸5min。產(chǎn)物通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V/cm，時(shí)間約60min)檢測(cè)見(jiàn)圖1。(3)目的基因測(cè)序:委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，應(yīng)用DNAMAN軟件、DNASTAR 軟件分析測(cè)序文本，得到SNP 位點(diǎn)3 種基因型的分布頻率，應(yīng)用Chromas 軟件分析測(cè)序波峰圖譜，觀察SNP 位點(diǎn)的雜合情況，見(jiàn)圖2。

圖1 rs7216389PCR 產(chǎn)物凝膠電泳圖

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:綜合整理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，病例組與對(duì)照組的等位基因及基因型頻率的差異性分析采用χ2檢驗(yàn)，多樣本間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Logistic 回歸進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

哮喘組對(duì)照組rs7216389 位點(diǎn)的基因型(TT/TC/CC)分別為(43%/39%/18%)與(28%/39%/33%)，等位基因頻率(T/C)分別為(62. 5%/37.5%)與(47.5%/52.5%)。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)，兩組間基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);等位基因頻率比較亦差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 兩組間rs7216389 位點(diǎn)基因型及等位基因的分布頻率比較［n(%)］

采用Logistic 回歸模型比較兩組間rs7216389 位點(diǎn)不同基因型的致病風(fēng)險(xiǎn)，相對(duì)于基因型CC，基因型TT 與TT+TC 均能增加哮喘發(fā)生率，而基因型TC可能與哮喘發(fā)生無(wú)關(guān)，詳見(jiàn)表2。

表2 兩組間rs7216389 位點(diǎn)不同基因型的相對(duì)危險(xiǎn)度的比較

針對(duì)ORMDL3 基因的表達(dá)可能存在種族、地域差異性，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)近幾年國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)報(bào)道所提出的關(guān)于rs7216389 位點(diǎn)等位基因T、C 的不同的分布頻率之間進(jìn)行比較(P ＜0.05)，提示ORMDL3基因rs7216389 位點(diǎn)可能存在顯著的種族差異，詳見(jiàn)表3。

表3 多種族、地域的哮喘人群間的rs7216389 位點(diǎn)等位基因頻率比較

討 論

ORMDL3 基因包括6560 個(gè)堿基對(duì)，包含3 個(gè)外顯子，編碼位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的由153 個(gè)氨基酸組成的4種跨膜蛋白，其序列高度保守，其表達(dá)產(chǎn)物在各組織中廣泛分布，尤其在成人肝臟、胰腺中，在胎兒的肺、肝臟、腎臟、脾臟中呈高水平表達(dá)，但具體功能目前還不明確［9，10］。近年來(lái)有研究推測(cè)該基因產(chǎn)物可能與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)［11］。ORMDL3 蛋白的表達(dá)異常以致未折疊蛋白反應(yīng)(URP)而促進(jìn)炎性反應(yīng)、致脂質(zhì)代謝紊亂而影響細(xì)胞功能及參與、影響呼吸道病毒感染等方式致?。?，9，11］。

rs7216389 及其周?chē)驗(yàn)榭绶N族的高度保守的非編碼區(qū)序列，與促炎性轉(zhuǎn)錄因子C/EBPb 具有高度同源性［12］。有研究表明T 等位基因可顯著增加波多黎各、日本、法籍加拿大、歐洲及墨西哥哮喘人群的患病風(fēng)險(xiǎn)，但是在非裔美洲人中未證實(shí)這一點(diǎn)［10］。Tavendale 等［13］在蘇格蘭青年(≤22 歲)人群中發(fā)現(xiàn)rs7216389 -T 與哮喘正相關(guān)，T 等位基因分布頻率越高，發(fā)生率越高。Bisgaard 等［14］在北歐地區(qū)發(fā)現(xiàn)rs7216389 -T 與早期哮喘有關(guān)。Wu 等［15］在墨西哥人群(4 ～17 歲)中發(fā)現(xiàn)rs7216389 -T 能夠顯著增加哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在我國(guó)南方地區(qū)、漢族及海南黎族的哮喘人群(包括成人及兒童)中，rs7216389 的基因分布頻率也有顯著差異［3，5］。孫婧等［16］將北京兒童哮喘病的嚴(yán)重程度分型后探究與ORMDL3 基因的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)rs7216389 位點(diǎn)與哮喘的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，其中，T 等位基因的攜帶者發(fā)生重度哮喘的風(fēng)險(xiǎn)更大，這一結(jié)論在英國(guó)地區(qū)也得到證實(shí)，即rs7216389易于誘發(fā)兒童發(fā)生重度哮喘［17］。

池穎靜等［3］針對(duì)南方成人哮喘患者起病年齡的不同分組研究發(fā)現(xiàn)，早發(fā)與晚發(fā)組在ORMDL3 的基因多態(tài)性分布上無(wú)明顯差異，從而得出盡管成年患者的起病存在環(huán)境因素的影響，rs7216389 -T 仍可提高哮喘易感性的結(jié)論。此外，崔云霞等［18］通過(guò)檢索和薈萃分析的方法分析了6 篇代表性良好的中外相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)一步證明了rs7216389 的多態(tài)性與兒童哮喘密切相關(guān)。綜上所述，各種族、地域的哮喘人群中采用不同的研究方法說(shuō)明rs7216389 與哮喘的相關(guān)性研究重復(fù)性較好，但是由于各人群遺傳背景不同、入選病例哮喘分型不同、SNP 間存在連鎖失衡的現(xiàn)象、環(huán)境因素及生活方式的影響、檢測(cè)方法各異等原因，致使如上結(jié)論還需要更多重復(fù)性驗(yàn)證。

本研究將哮喘患者中該位點(diǎn)基因型(TT/TC/CC)的分布頻率、等位基因的分布頻率分別與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明rs7216389 與哮喘發(fā)病相關(guān)。相對(duì)于基因型CC，基因型TT(OR =0.335，P=0. 007)與基因型TT + TC(OR = 0.446，P =0.016)均能顯著增加哮喘易感性，而基因型TC(OR=0.545，P=0.102)則可能與哮喘無(wú)關(guān)。

綜上所述，通過(guò)本研究可以發(fā)現(xiàn)攜帶T 等位基因的純合子TT 可能提高哮喘發(fā)生率，而同為攜帶T 等位基因的雜合體TC 及攜帶C 等位基因的純合子CC可能與哮喘無(wú)關(guān)，甚至發(fā)揮負(fù)效應(yīng)。筆者發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的C 等位基因頻率(52.5%)高于哮喘組(37.5%)，據(jù)此可以推測(cè)T 等位基因可能是哮喘的易感基因，而C 等位基因可能是保護(hù)基因，這一結(jié)論與Moffatt、Wu等［15］、Tavendale 等［13］、Bisgaard 等［14］及黃漢琮［6］、池穎靜等［3］的發(fā)現(xiàn)是一致的。故rs7216389 及其相鄰基因可以作為重要的遺傳標(biāo)記，預(yù)測(cè)哮喘的發(fā)病可能，為該病的早期診斷提供分子遺傳學(xué)依據(jù)。

為了進(jìn)一步明確SNPrs7216389 的等位基因T、C在多種族人群中的分布頻率有無(wú)差異，本研究采用χ2檢驗(yàn)比較了包括我國(guó)內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古族在內(nèi)的亞、歐、美洲人種(波多黎各、德國(guó)、澳大利亞、墨西哥、日本)間的T、C 等位基因頻率分布，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，這一結(jié)論與Glanter 等關(guān)于rs7216389 -T 與多種族人群的哮喘相關(guān)性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)論是一致的。

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