楊 濤 王惠明 顏 奇 丁國華

慢性腎臟病(CKD)患者隨著腎功能的減退，將不可逆的向終末期腎病進(jìn)展，需腎臟替代治療。研究顯示CKD 3 期后的患者病死率逐漸升高，死亡原因中感染占第2 位［1］。慢性腎臟病患者感染呈現(xiàn)發(fā)生率高、易反復(fù)、病情重、病死率高等特點(diǎn)，免疫功能紊亂是患者感染的重要因素。尿毒癥患者的免疫功能下降與尿毒癥狀態(tài)下各種免疫細(xì)胞的功能異常相關(guān)，這些免疫細(xì)胞包括:中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞、T/B 淋巴細(xì)胞等［2］。這些免疫細(xì)胞可表現(xiàn)為絕對數(shù)量的異常、分泌各種細(xì)胞因子的異常、表面受體/配體的表達(dá)異常，它們之間的相互影響、相互作用促成尿毒癥患者免疫功能的異常。

CD40 分子屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于不同分化階段的B細(xì)胞、造血前體細(xì)胞、單核- 吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)和多種不同組織來源的腫瘤細(xì)胞等。CD154 是CD40 分子的配體(CD40L)，CD154 也稱gp39、腫瘤壞死因子相關(guān)激活蛋白(TRAP)、T 細(xì)胞-B 細(xì)胞活化分子(T-BAM)，為33kDa 的Ⅱ型跨膜糖蛋白，共有266aa，其中胞膜外區(qū)214 個氨基酸，與TNF 在氨基酸水平具有較高的同源性。CD154 主要表達(dá)于活化的CD4+T 淋巴細(xì)胞，部分活化的CD8+T 細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、NK 細(xì)胞也有表達(dá)?；罨疶細(xì)胞膜表達(dá)CD154 與CD40 的結(jié)合，為T/B 細(xì)胞活化提供必需的第二信號，對B 細(xì)胞的激活、增殖、同型轉(zhuǎn)換、漿細(xì)胞抗體的表達(dá)，對T 細(xì)胞活化增殖，對抗原遞呈細(xì)胞的成熟等均有有著重要的臨床意義［3～6］。Contin 等［7］研究顯示抑制B 細(xì)胞上CD40 與配體CD154 的結(jié)合，可導(dǎo)致B 細(xì)胞分泌的免疫球蛋白減少。目前尚無CKD 3 ～5 期患者T 細(xì)胞CD154 表達(dá)變化的相關(guān)報(bào)道。本研究針對慢性腎臟病患者T 細(xì)胞上CD154 的表達(dá)，從T 細(xì)胞角度探討了CKD 3 ～5期患者的免疫功能紊亂。

資料與方法

1.一般資料:選取健康人為對照組，CKD 3 ～5 期未透析患者、CKD5 期透析患者為實(shí)驗(yàn)組，檢測各組受試者外周血T細(xì)胞比例、活化T 細(xì)胞CD154 的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn):慢性腎臟病3 ～5 期未透析患者;透析組選取血液透析或腹膜透析超過6 個月患者。實(shí)驗(yàn)組排除標(biāo)準(zhǔn):①合并有糖尿病或原發(fā)病為糖尿病腎病患者，系統(tǒng)性紅斑狼瘡等風(fēng)濕性疾病所致腎衰竭患者，腎臟淀粉樣變患者，腫瘤患者;②近期合并感染性疾病、消化道出血、嚴(yán)重心腦血管疾病患者;③CKD 并發(fā)急性腎損傷患者。健康人群17 人(男性/女性為10/7)，患者平均年齡50.18±3.36 歲;未透析組30 人(男性/女性為19/11)，患者平均年齡56.10±3.06 歲;透析組20 人(男性/女性為12/8)，患者平均年齡53.10±3.78 歲，年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.主要試劑及儀器:紅細(xì)胞裂解液購自美國Biolegend 公司;淋巴細(xì)胞分離液購自中國達(dá)科為公司;鼠抗人的PE antihuman CD40L、FITC anti - human CD3、APC anti -human CD8及同型對照購自美國Biolegend 公司;離子霉素(Inomycin)及佛波酯(PMA)購自美國Alexis 公司;流式細(xì)胞儀為BD Accuri C6。

3.檢測方法:活化CD4+T 淋巴細(xì)胞及表面CD154 的檢測:采用肝素抗凝管留取受試者外周血，取全血200μl 加入RPMI 1640 培養(yǎng)基800μl，加入離子霉素(1μg)+佛波酯(50ng)，孵育5h，采用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，運(yùn)用Biolegend 公司的PE anti-human CD154、FITC anti -human CD3、APC anti -human CD8 及同型對照染色，流式細(xì)胞儀分析。取2ml 全血運(yùn)用淋巴細(xì)胞分離液獲取PBMC，一部分同上直接染色，流式細(xì)胞儀分析，另一部分運(yùn)用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，按2 ×106/ml 比例加入1640 完全培養(yǎng)基(加有10% 的小牛血清)，加入離子霉素(1μg)+佛波酯(50ng)，孵育5h，染色后流式細(xì)胞儀分析。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 17.0、GraphPad Prism、BD Accuri C6 自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、做圖，多組間比較采用單因素方差分析，兩變量之間的相關(guān)關(guān)系采用一元線性相關(guān)分析，實(shí)驗(yàn)組與正常組配對做t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組外周血T 細(xì)胞頻率比較:相對于對照組，CKD 3 ～5 期未透析組患者外周血淋巴細(xì)胞中T 細(xì)胞頻率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);CKD5 期透析組較對照組及未透析組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對照組為72.05% ±2.65%;未透析組為63.06% ±3.37%;透析組為68.92% ±3.22%)(P ＜0.05，圖1)。

圖1 各組外周血淋巴細(xì)胞中T 淋巴細(xì)胞表達(dá)頻率

2. 各組受試者外周血CD3+CD8-T 細(xì)胞上CD154 的比較:未活化的T 細(xì)胞在各組均未見CD154明顯表達(dá);運(yùn)用離子霉素聯(lián)合佛波脂刺激T 細(xì)胞后可見CD154 的表達(dá)上調(diào)。各組全血提取PBMC 后再刺激，實(shí)驗(yàn)組CD3+CD8-T 細(xì)胞上CD154 表達(dá)較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對照組65.33% ±3.00%;未透析組59.72% ±3.01%;透析組65.53% ±1.63%);各組全血刺激后，CKD 3 ～5 期未透析組CD3+CD8-T 細(xì)胞CD154 表達(dá)下降(P = 0. 037)，維持性透析組CD3+CD8-T 細(xì)胞上CD154 的表達(dá)較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對照組79.78% ± 2. 00%;未透析組73.61% ± 1. 91%;透析組78. 94% ± 2.47%，P ＜0.05，詳見圖2、圖3。

討 論

圖2 各組PBMC 刺激后CD3 +CD8 - CD154 + T 細(xì)胞占CD3 +CD8 - T 細(xì)胞頻率

健康人外周血淋巴細(xì)胞中T 細(xì)胞比例為70% ～80%。本研究顯示，相對于對照組CKD 3 ～5 期未透析患者存在淋巴細(xì)胞比例下降，透析后比例恢復(fù)正常，說明在非透析患者中存在影響T 細(xì)胞比例的因素。在運(yùn)用離子霉素及佛波酯激活T 細(xì)胞過程中，CD4+T 細(xì)胞表面的CD4 的表達(dá)下調(diào)，故本研究檢測CD8-T 細(xì)胞代表CD4+T 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中可見各組外周血在去除血漿及其他細(xì)胞的影響后(提取PBMC)，其活化的CD3+CD8-T 淋巴細(xì)胞上CD154 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在全血刺激后，CKD 3 ～5 期未透析組CD3+CD8-T 細(xì)胞CD154 表達(dá)明顯下調(diào)，維持性組CD154 表達(dá)恢復(fù)。此現(xiàn)象說明，在CKD 3 ～5 期未透析患者中，存在抑制CD154 表達(dá)的因素。

Yoon 等［8］報(bào)道尿毒癥患者毒素蓄積(如氮質(zhì)血癥、氧化應(yīng)激、糖基化終末產(chǎn)物、鐵的超負(fù)荷、炎癥)所致幼稚T 細(xì)胞、記憶T 細(xì)胞凋亡、耗損增加。本實(shí)驗(yàn)中CKD 3 ～5 期患者外周血T 細(xì)胞頻率下降與之相關(guān)。CKD 3 ～5 期未透析患者外周血同時(shí)存在T 細(xì)胞比例下降，膜表面CD154 的表達(dá)下調(diào)，可能影響了患者T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。透析后患者T 細(xì)胞表達(dá)頻率及膜表面CD154 表達(dá)恢復(fù)可能與相關(guān)抑制因素清除相關(guān)。有研究顯示，炎性細(xì)胞中也可見CD154 與CD40 的表達(dá)，這些炎性細(xì)胞也可能會影響到細(xì)胞活化，刺激CD154 的表達(dá);維持性透析中，機(jī)體會接觸各種異體物質(zhì)，可能刺激炎癥產(chǎn)生，上調(diào)了T 細(xì)胞上CD154 的表達(dá)［9］。本實(shí)驗(yàn)中未明確影響T 細(xì)胞CD154 表達(dá)能力的具體因素，但慢性腎臟病患者存在各種尿毒癥毒素的蓄積，推測其表達(dá)下調(diào)可能為各種毒素協(xié)同所致。

綜上所述，CKD 3 ～5 期未透析患者存在T 細(xì)胞的頻率下降，同時(shí)伴有CD3+CD4+T 細(xì)胞CD154 的表達(dá)能力下降，可能是患者免疫力下降、容易感染的重要原因。

圖3 全血刺激后各組CD3 +CD8 - CD154 + T 細(xì)胞占CD3 +CD8 - T 細(xì)胞頻率

1 Kato S，Chmielewski M，Honda H，et al.Aspects of immune dysfunction in end- stage renal disease［J］. Clin J Am Soc Nephrol，2008，3:1526 -1533

2 Eleftheriadis T，Antoniadi G，Liakopoulos V，et al. Disturbances of acquired immunity in hemodialysis patients［J］. Semin Dial，2007，20:440 -451

3 Durie FH，F(xiàn)oy TM，Masters SR，et al. The role of CD40 in the regulation of humoral and cell - mediated immunity［J］. Immunol Today，1994，15:406 -411

4 Klaus SJ，Berberich I，Shu G，et al. CD40 and its ligand in the regulation of humoral immunity［J］. Semin Immunol，1994，6:279 -286

5 Schonbeck U，Libby P. The CD40/CD40L receptor/ligand dyad［J］.Cell Mol Life Sci，2001，58 (1):4 -43

6 O'Sullivan B，Thomas R. CD40 and dendritic cell function［J］. Crit Rev Immunol，2003，23:83 -107

7 Contin C，Pitard V，Delmas Y，et al. Potential role of soluble CD40 in the humoral immune response impairment of uraemic patients［J］. Immunology，2003，11:131 -140

8 Yoon J，Gollapudi S，Pahl M，et al. Na?ve and Central Memory T -cell lymphopenia in endstage renal disease［J］. Kidney Int，2006，70:371 -376

9 Rizvi M，Pathak D，F(xiàn)reedman JE，et al. CD40 -CD40 ligand interactions in oxidative stress，inflammation and vascular disease［J］. Trends Mol Med，2008，14:530 -538