陳慧君 黃亦波 林蓉蓉 鄭飛云

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)又稱子宮體癌，是常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，在全球占女性生殖道惡性腫瘤20% ～30%，發(fā)生率呈逐年上升趨勢［1］。有研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用［2］。本研究通過在子宮內(nèi)膜腺癌HEC -1 -B細(xì)胞中過表達(dá)miR-449b，初步探討其對子宮內(nèi)膜腺癌HEC-1 -B 細(xì)胞的細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用的分子途徑。

材料與方法

1.材料:胎牛血清、Opti -MEM、DMEM 培養(yǎng)液(Gibco 公司)，lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen 公司)，hsa -miR-449b mimics、miRNA mimics 陰性對照(上海吉瑪公司)，hsa-miR-449b 上游引物及U6 上游引物(上海生工公司)，SYBR GREEN(Toyobo 公司)，CCK-8 試劑、凋亡試劑盒、結(jié)晶紫細(xì)胞染色液(碧云天生物技術(shù)研究所)，Trizol 試劑、miRNA反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒(Invitrogen 公司)，兔抗E2F3 抗體、鼠抗p53 抗體(Abcam 公司)，鼠抗β-actin 抗體、山羊抗兔抗體、山羊抗鼠抗體(Bioworld 公司)

2.方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:HEC-1 -B 細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染前24h，以2.5 ×105/ml 的細(xì)胞數(shù)接種于6 孔板(96 孔板接種細(xì)胞數(shù)為2500/ml)，置37℃，5%飽和濕度CO2的培養(yǎng)箱過夜后，按照lipofectamine 2000 說明書分別轉(zhuǎn)染has-miR-449b mimics 和miRNA mimics 陰性對照。轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)培養(yǎng)來完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(miR -449b mimics 轉(zhuǎn)染組)和NC 組(miRNA mimics 陰性轉(zhuǎn)染組)。(2)RNA 的提取及實(shí)時熒光定量PCR 檢測miR -449b 的水平:轉(zhuǎn)染48h 后，Trizol 手工法提取細(xì)胞總RNA，保證A260/A280 在1.8 ～2.0 范圍內(nèi)。SYBR GREEN 試劑盒內(nèi)提供RT及qPCR 通用引物，操作步驟按其說明書進(jìn)行，先將miRNA 加多聚A 尾，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR 反應(yīng)體系為10μl:SYBR GREEN Mix5μl、cDNA 模板1μl、qPCR 通用引物1μl、上游引物1μl、ddH2O 2μl。miRNA-449b 特異上游引物序列為5' -AGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGC-3'，以U6 為內(nèi)參物，上游引物序列為5' - CGCAAGGATGACACGCAAATTC -3'。反應(yīng)條件:95℃變性3min 后，95℃5s，62℃40s 擴(kuò)增40 個循環(huán)。結(jié)果CT 值以2-ΔΔCt方法，來表示miR -449b 的表達(dá)量。(3)細(xì)胞增殖活性檢測:將HEC-1 -B 細(xì)胞接種于96 孔板，2500個細(xì)胞/孔，培養(yǎng)基100 微升/孔，每組設(shè)6 個復(fù)孔，24h 后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24、48、72h 后，每孔更換100μl 無雙抗血清的DMEM培養(yǎng)基，加入10μl CCK -8 原液，避光置于培養(yǎng)箱孵育，每30min 酶標(biāo)儀檢測450nm 波長的吸光度，直至NC 組吸光度值接近1。(4)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染72h 后，胰酶消化、離心、重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以500 個細(xì)胞/孔接種于6 孔板(培養(yǎng)基2 毫升/孔)，輕輕搖動混勻，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 天更換培養(yǎng)液，約14 天后，肉眼可見6 孔板底部成團(tuán)的克隆團(tuán)，停止繼續(xù)培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液，PBS 洗3 遍，4%多聚甲醛固定15min后，結(jié)晶紫避光染色30min，PBS 洗3 遍，空氣干燥，相機(jī)拍照，計(jì)克隆數(shù)。每孔加入500μl 34%冰乙酸萃取，100 微升/孔加至96 孔板中檢測590nm 波長的吸光度。(5)細(xì)胞凋亡檢測:6孔板鋪板，轉(zhuǎn)染72h 后，制備單細(xì)胞懸液，PBS 洗滌、離心2次，根據(jù)Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒的說明書對細(xì)胞進(jìn)行染色后，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況。(6)蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測E2F3 和p53 表達(dá):采用常規(guī)Western blot 方法，抗體濃度按其說明書稀釋，經(jīng)辣根過氧化物酶催化底物發(fā)光，系統(tǒng)照相，Image Lab 軟件分析E2F3 和p53 表達(dá)變化(表達(dá)量以光密度數(shù)值表示)。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組數(shù)據(jù)比較運(yùn)用單因素方差分析，進(jìn)行兩兩比較。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.轉(zhuǎn)染后miR-449b 表達(dá)上調(diào):轉(zhuǎn)染48h 后，通過實(shí)時熒光定量PCR 檢測miR-449b 的表達(dá)量。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR -449b 表達(dá)量:610.84 ±41.35。實(shí)驗(yàn)組miR-449b 表達(dá)量高于NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，圖1 ～圖4)。

2.miR-449b 抑制細(xì)胞增殖:分別轉(zhuǎn)染24、48 和72h 后用CCK - 8 試劑盒檢測實(shí)驗(yàn)組和NC 組的HEC-1 -B 細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24h:實(shí)驗(yàn)組為0.95 ±0.04，NC 組為1.00 ±0.06;轉(zhuǎn)染48h:實(shí)驗(yàn)組為0.84 ±0.05，NC 組為0.98 ±0.04;轉(zhuǎn)染72h:實(shí)驗(yàn)組為0.58 ±0.07，NC 組為1.02 ±0.05。各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性均較NC 組弱，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，圖5)。

圖1 U6 溶解曲線

圖2 miR-449b 溶解曲線

圖3 擴(kuò)增曲線

圖4 實(shí)時熒光定量PCR 檢測miR-449b表達(dá)情況(2 -ΔΔCt法)

圖5 轉(zhuǎn)染24、48、72h 后細(xì)胞增殖情況(450nm 波長)

3.miR-449b 抑制細(xì)胞克隆形成:HEC -1 - B細(xì)胞培養(yǎng)14 天后，結(jié)晶紫染色結(jié)果如圖，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成能力下降。用冰醋酸萃取后，測590nm 吸光度結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組為0. 51 ± 0. 01，NC 組為0.98 ±0.27，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，圖6)。

圖6 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

4.miR-449b 促進(jìn)細(xì)胞凋亡;轉(zhuǎn)染72h 后流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組為24.70% ±0.56%，NC 組為10.90% ±0.64%。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，圖7)。

圖7 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡情況

5. E2F3 和p53 的表達(dá)情況:實(shí)驗(yàn)組較NC 組E2F3 表達(dá)水平下調(diào)，p53 表達(dá)水平上調(diào)(圖8)。

圖8 E2F3、p53 表達(dá)情況

討 論

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為22 ～25 個核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，功能是通過與靶基因3UTR 上的結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，在細(xì)胞生長、分化及凋亡等多種生物過程中發(fā)揮作用［3，4］。隨著miRNA 研究的深入，近年miRNA 與腫瘤的相關(guān)性越來越受到人們的重視，有研究報(bào)道癌組織和癌細(xì)胞中miRNA 表達(dá)差異明顯，可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2，5］。子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，分為雌激素依賴型(Ⅰ型)和非雌激素依賴型(Ⅱ型)，目前關(guān)于miRNA 在子宮內(nèi)膜癌中的生物學(xué)影響及作用機(jī)制研究甚少。

miR-449 是近年新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展［6］。miR-449 既能通過自動調(diào)節(jié)反饋機(jī)制調(diào)控細(xì)胞周期負(fù)反饋調(diào)控通路，又能直接靶向識別及調(diào)控靶基因的表達(dá)，對細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK 家族進(jìn)行調(diào)控。在細(xì)胞增殖方面，Marcet 等［7］研究顯示miR -449 能影響Notch 信號通路，抑制細(xì)胞增殖。而在肝癌細(xì)胞系中，Zhang 等［8］發(fā)現(xiàn)miR -449 通過阻礙脂代謝相關(guān)的SIRT1 通路抑制細(xì)胞增殖。在胃癌中，Bou Kheir等［9］研究顯示miR -449 的直接靶基因有GMNN、MET、CCNE2、SIRT1，通過與靶基因的3UTR 結(jié)合沉默靶基因的表達(dá)，間接上調(diào)細(xì)胞p53 和p21 的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖能力。在細(xì)胞凋亡方面，Lize等［10］研究發(fā)現(xiàn)miR-449 和miR-34 調(diào)節(jié)E2F-p53負(fù)反饋循環(huán)系統(tǒng)的平衡來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Feng 等［11］研究顯示miR-449 調(diào)節(jié)反饋機(jī)制調(diào)控細(xì)胞周期負(fù)反饋調(diào)控通路CDK -Rb -E2F1，miR -449 下調(diào)pRb-E2F1 的表達(dá)，靶向沉默CDK6 和CDK25A，導(dǎo)致pRb 脫磷酸化。而在婦科腫瘤方面，Jang 等［12］研究發(fā)現(xiàn)miR-449 在卵巢和子宮透明細(xì)胞癌中低表達(dá)。

筆者之前的研究［13］通過基因芯片的篩查發(fā)現(xiàn)miR-449a 及miR -449b 在子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)存在差異，這與其在胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中表達(dá)一致［8，9，14］。并且在后續(xù)研究［15］中，我們發(fā)現(xiàn)miR -449a 能抑制HEC -1 -B 細(xì)胞的生長。而本研究同樣以子宮內(nèi)膜腺癌HEC -1 - B 細(xì)胞為對象，通過轉(zhuǎn)染has-miR-449b mimics 使miR -449b 表達(dá)上調(diào)，通過實(shí)時熒光定量PCR 驗(yàn)證HEC -1 -B 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-449b 表達(dá)量明顯高于NC 組，證實(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。CCK-8 和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞增殖明顯受抑制，說明miR-449b 能抑制HEC -1 -B 細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡顯示細(xì)胞凋亡增加明顯，說明miR-449b 能促進(jìn)HEC -1 -B細(xì)胞凋亡。

E2F3 屬于轉(zhuǎn)錄因子E2F 家族，參與調(diào)控細(xì)胞周期由G 期進(jìn)入S 期，促進(jìn)細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化，是細(xì)胞周期重要的轉(zhuǎn)錄因子［16］。E2F3 可以和DP 蛋白結(jié)合形成二聚體，進(jìn)而與靶基因的啟動子結(jié)合來調(diào)控轉(zhuǎn)錄。E2F3 活性受到腫瘤抑制因子Rb 磷酸化的直接調(diào)控。E2F3 與去磷酸化的Rb 結(jié)合而失活，使細(xì)胞周期于G1/S 期停滯，細(xì)胞增殖停止;E2F3 被釋放而活化時，細(xì)胞周期順利度過G1/S 期，促進(jìn)細(xì)胞增殖［17］。E2F3 這種作用也同樣促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖，在腫瘤發(fā)展過程中起重要作用［18］。而p53 屬于p53 基因家族，是一種抑癌基因，具有阻滯細(xì)胞周期、修復(fù)受損DNA、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞過度增殖等功能。有研究表明過表達(dá)miR - 34 家族能調(diào)節(jié)E2F-p53 的平衡來誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。本研究用Western blot 方法證實(shí)轉(zhuǎn)染miR -449b 后E2F3 蛋白的表達(dá)下調(diào)及p53 蛋白的表達(dá)上調(diào)，表明miR-449b 可調(diào)節(jié)E2F3 -p53 負(fù)反饋循環(huán)系統(tǒng)，可能參與其信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞周期過程，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究證明miR -449b 能抑制子宮內(nèi)膜腺癌HEC-1 -B 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)HEC -1 -B細(xì)胞的凋亡。轉(zhuǎn)染miR -449b 后E2F3 的表達(dá)下調(diào)和p53 的表達(dá)上調(diào)，說明miR - 449b 可作用于E2F3 -p53 負(fù)反饋循環(huán)系統(tǒng)來調(diào)控影響細(xì)胞周期，在子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起作用，且有可能成為子宮內(nèi)膜腺癌靶向治療的靶點(diǎn)。本研究初步提示了miR-449b 在子宮內(nèi)膜腺癌HEC-1 -B 細(xì)胞中的生物學(xué)功能和分子調(diào)控機(jī)制。而miR -449b 還通過哪些其他分子機(jī)制作用于子宮內(nèi)膜腺癌中還有待于進(jìn)一步研究。

1 Jemal A，Bray F，Center MM，et al. Global cancer statistics［J］. CA Cancer J Clin，2011，61(2):69 -90

2 Bouyssou JM，Manier S，Huynh D，et al. Regulation of micrornas in cancer metastasis［J］. Biochim Biophys Acta，2014，1845(2):255 -265

3 Lee Rosalind C，F(xiàn)einbaum Rhonda L，Ambros Victor. The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small rnas with antisense complementarity to Lin-14［J］. Cell，1993，75:843 -854

4 Ambros V，Lee Rosalind C. Identification of micrornas and other tiny noncoding Rnas by Cdna cloning［J］.MethodsMol Biol，2004，265:131 -158

5 Kisseljov FL.Micrornas and cancer［J］. Molecular Biology，2014，48(2):197 -206

6 Muriel L，Alexander K，Matthias D. Microrna-449 in cell fate determination［J］. Cell Cycle，2014，10(17):2874 -2882

7 Marcet B，Chevalier B，Luxardi G，et al. Control of vertebrate multiciliogenesis by Mir-449 through direct repression of the delta/notch pathway［J］. Nat Cell Biol，2011，13(6):693 -699

8 Zhang H，F(xiàn)eng Z，Huang R，et al. Microrna-449 suppresses proliferation of hepatoma Cell lines through blockade lipid metabolic pathway related to Sirt1［J］. Int J Oncol，2014，45(5):2143 -2152

9 Bou Kheir T，F(xiàn)utoma-Kazmierczak E，Jacobsen A，et al. Mir-449 inhibits cell proliferation and is down - regulated in gastric cancer［J］. Mol Cancer，2011，10(29):40

10 Lize M，Pilarski S，Dobbelstein M. E2f1 -inducible microrna 449a/B suppresses cell proliferation and promotes apoptosis［J］. Cell Death Differ，2010，17(3):452 -458

11 Feng M，Yu Q. Mir - 449 regulates Cdk - Rb - E2f1 through an auto-regulatory feedback circuit［J］. Cell Cycle，2014，9(2):213 -214

12 Jang SG，Yoo CW，Park SY，et al. Low expression of Mir-449 in gynecologic clear cell carcinoma［J］. Int J Gynecol Cancer，2014，24(9):1558 -1563

13 薛紀(jì)森，張乾，李曉琳，等. Mir-449a/B 在ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)下調(diào)［J］. 醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41(11):103 -107

14 Fang Y，Gu X，Li Z，et al. Mir -449b Inhibits the proliferation of sw1116 colon cancer stem cells through downregulation of Ccnd1 and E2f3 expression［J］. Oncol Rep，2013，30(1):399 -406

15 Ye W，Xue J，Zhang Q，et al. Mir -449a functions as a tumor suppressor in endometrial cancer by targeting Cdc25a［J］. Oncol Rep，2014，32(3):1193 -1199

16 King J，Moskowitz PG，Burgon PG，et al. E2f3 plays an essential role in cardiac development and function［J］. Cell Cycle，2008，7(23):3775 -3780

17 Giangrande PH，Zhu WC，Nevins JR. E2fs link the control of G1/S and G2/M transcription［J］. EMBO J，2004，23:4615 -4626

18 Miles WO，Tschop K，Herr A，et al. Pumilio facilitates mirna regulation of the E2f3 oncogene［J］. Genes Dev，2012，26(4):356 -368