藍(lán)松松 吳樂燦 吳金明 王秀燕 林賢凡 吳文治 黃智銘 吳建勝

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB，以下簡(jiǎn)稱乙肝)嚴(yán)重危害公眾健康。全球4 億多慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者有極大風(fēng)險(xiǎn)將進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭和肝癌等疾病［1］。目前認(rèn)為機(jī)體對(duì)乙型肝炎病毒產(chǎn)生免疫耐受，不能產(chǎn)生有效的特異性免疫反應(yīng)是導(dǎo)致HBV 慢性感染的主要原因。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)作為已知功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，在機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者的樹突狀細(xì)胞存在功能缺陷，其激活特異性抗病毒免疫反應(yīng)，特別是細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力明顯低下［2］。這一現(xiàn)象可能與乙肝病毒和(或)其抗原成分影響DC分化成熟有關(guān)。乙肝e 抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)是乙型肝炎病毒復(fù)制期間產(chǎn)生的可溶性核衣殼抗原的分泌形式，被認(rèn)為是宿主對(duì)乙肝病毒形成免疫耐受的重要因素［3］。同時(shí)，HBeAg 也是臨床上預(yù)測(cè)慢性HBV 感染者病情轉(zhuǎn)歸的重要指標(biāo)之一。HBeAg 可能通過影響DC，下調(diào)特異性細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致HBV 感染慢性化，但對(duì)此明確作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍十分有限。本研究以體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞為研究對(duì)象，用HBeAg 進(jìn)行干預(yù)，探討HBeAg 對(duì)樹突狀細(xì)胞表型及功能的影響，并分析其與乙肝免疫耐受的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明乙型慢性化機(jī)制提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.主要材料:健康C57BL/6 小鼠，6 ～8 周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，為SPF 級(jí)。LPS 購(gòu)自Sigma 公司;HBeAg 購(gòu)自北京科衛(wèi)試劑公司。RPMI-1640、胎牛血清購(gòu)自Gibico 公司。rmGM -CSF、rmIL -4 購(gòu)自PeproTech 公司。CD11c microbeads、磁柱購(gòu)自Miltenyi Biotec 公司。APC 標(biāo)記的CD11c 及同型對(duì)照購(gòu)自BioLegend 公司。FITC 標(biāo)記的MHC-Ⅱ，PE - 標(biāo)記的CD86 及同型購(gòu)自eBioscience 公司。CCK-8 購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。mouseIL -12p70 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自RD 公司。

2.C57BL/6 小鼠骨髓DCs 的制備及分組:C57BL/6 小鼠斷頸處死，無菌條件下分離小鼠股骨和脛骨。剪除骨兩端，用1ml 注射器吸取RPMI1640 反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨變白為止，收集沖洗液，經(jīng)100 目無菌尼龍濾網(wǎng)過濾后1200r/min 離心10min，去上清后加入適量Tris-NH4Cl 破解紅細(xì)胞，再用PBS 洗2 次。將骨髓細(xì)胞用含10%胎牛血清、1ng/ml rmIL-4、10ng/ml rmGM-CSF和1%青鏈雙抗的完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，接種至6 孔培養(yǎng)板中。在37℃、5%CO2條件下貼壁3h 后，去除非貼壁細(xì)胞，補(bǔ)足完全培養(yǎng)液。隔日半量換液。待培養(yǎng)第6 天，收集細(xì)胞，隨機(jī)分為4 組:空白對(duì)照組，未加任何刺激即immatureDC(iDC);HBeAg 組，HBeAg(5μg/ml)共培養(yǎng)24h;LPS 刺激組，LPS(1μg/ml)繼續(xù)刺激24h;HBeAg+LPS 刺激組，先在培養(yǎng)基中加入5μg/ml HBeAg 培養(yǎng)24h 后，再行LPS(1μg/ml)刺激24h。

3.骨髓源性樹突狀細(xì)胞的流式鑒定:收集各組懸浮和半貼壁細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)1 ×107/ml，取0.5ml 加入APC 標(biāo)記的小鼠CD11c 抗體孵育后，通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)CD11c 陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

4.細(xì)胞純化后表型鑒定:收集懸浮和半貼壁細(xì)胞，加入CD11c Microbeads，應(yīng)用MiniMACS 免疫磁珠分選系統(tǒng)分離純化樹突狀細(xì)胞，流程嚴(yán)格按試劑說明書操作。收集分選后的細(xì)胞，PBS 洗2 次，分別加入PE-CD86 和FITC-MHC-Ⅱ及相應(yīng)同型對(duì)照抗體各2μl，，4℃孵育30min 后，流式檢測(cè)儀觀察DCs 表面分子變化。

5.同種異體混合淋巴反應(yīng)(MLR):25μg/ml 絲裂霉素C處理各組DC，37℃孵育30min 后，PBS 洗2 次，再用完全RPMI-1640 培養(yǎng)液重懸成5 ×105/ml，作為刺激細(xì)胞。將BALB/c 小鼠脾T 淋巴細(xì)胞和各組DC 加入96 孔板共培養(yǎng)，每孔加入淋巴細(xì)胞100μl，然后分別加入40、20、10μl 的DC 細(xì)胞，每組各設(shè)3 個(gè)副孔，加培養(yǎng)液至總體積200μl，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育96h。另設(shè)只含淋巴細(xì)胞的孔為對(duì)照組，含RPMI-1640 的孔為本底組。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔各加入CCK-8 試劑20μl，繼續(xù)孵育4h，振蕩混勻后，于參比波長(zhǎng)650nm、檢測(cè)波長(zhǎng)450nm 處測(cè)定其吸光度(A 值)。刺激結(jié)果用刺激指數(shù)(stimulating index，SI)表示。SI = (實(shí)驗(yàn)組- 本底)/(對(duì)照組-本底)。

6.不同濃度HBeAg 共培養(yǎng)后細(xì)胞上清液炎性因子變化:收集細(xì)胞上清液，采用IL-12 ELISA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-12p70 濃度。操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣本450nm 吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定相應(yīng)濃度。

7.HBeAg 對(duì)骨髓源性樹突狀細(xì)胞活力影響的檢測(cè):制備小鼠骨髓源性DC，待體外誘導(dǎo)分化第6 天收集懸浮及半貼壁細(xì)胞，經(jīng)CD11c 磁珠分選純化，具體步驟如上述。將分選后細(xì)胞重懸成106/ml 后，在96 孔板中接種細(xì)胞懸液(100 微升/孔)，分別加入1、2、5μg/ml HBeAg，加培養(yǎng)液至總體積200μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育96h。另設(shè)只含DC 的孔為對(duì)照孔。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔各加入CCK-8 試劑20μl，繼續(xù)孵育4h，振蕩混勻后，于檢測(cè)波長(zhǎng)450nm 處測(cè)定其吸光度(A 值)。細(xì)胞活力(%)=HBeAg 干預(yù)孔A/對(duì)照孔A×100%。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。數(shù)據(jù)采用t 檢驗(yàn)或單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Levene 法檢驗(yàn)方差齊性，組間多重比較用LSD 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HBeAg 對(duì)小鼠骨髓源性CD11c 陽(yáng)性細(xì)胞百分率:統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示空白對(duì)照組和LPS 刺激組CD11c陽(yáng)性的DCs 百分率均＞70%，明顯高于HBeAg 組和HBeAg + LPS 刺激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明HBeAg具有一定抑制骨髓前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化為樹突狀細(xì)胞的作用(圖1)。

圖1 不同培養(yǎng)條件下CD11c 陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)

2.DC 表面分子表達(dá)的檢測(cè):流式檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫磁珠純化后，CD11c 陽(yáng)性細(xì)胞百分率達(dá)到95%以上，該純度可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。未刺激組DC 表面MHC -Ⅱ和CD86 的表達(dá)較低。LPS 刺激后細(xì)胞表面MHC-Ⅱ和CD86 表達(dá)顯著升高。HBeAg 組CD86與MHC-Ⅱ與未刺激組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。HBeAg+LPS 共刺激組DC 表面CD86 與MHC-Ⅱ均明顯低于LPS 組(P ＜0.01)，提示HBeAg 可明顯抑制LPS 刺激DC 表面重要免疫因子的表達(dá)(圖2)。

圖2 不同培養(yǎng)條件下樹突狀細(xì)胞表面MHC-Ⅱ和CD86 表達(dá)的變化

3.樹突狀細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測(cè):MLR 結(jié)果顯示LPS 刺激成熟的DC 促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的能力明顯高于其他3 組。未刺激組(對(duì)照組)與HBeAg 組促淋巴細(xì)胞增殖能力均較低，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。HBeAg 處理過的DC 再經(jīng)LPS刺激，其促異體淋巴細(xì)胞增殖能力提高有限，提示HBeAg 可能通過抑制DC 刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能(圖3)。

圖3 樹突狀細(xì)胞促T 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12p70 分泌水平:空白對(duì)照組、HBeAg 刺激組、LPS 刺激組和HBeAg + LPS組IL -12p70 分泌水平分別為28.01 ±10.21pg/ml、38.92 ±12.18pg/ml、1545.55 ±263.98pg/ml 和513.53±66.77pg/ml，方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果顯示方差不齊(Levene法，P ＜0.05)，用Dunnett T3 檢驗(yàn)行組間多重比較。LPS 刺激后DC 分泌IL -12p70 明顯升高，與余3 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＜0.01)。經(jīng)HBeAg 預(yù)處理再以同等劑量LPS 刺激后IL -12p70 分泌高于空白組(P ＜0.01)，但仍明顯低于LPS 組(P ＜0.01)。HBeAg 組的IL-12p70 分泌量與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，與另兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＜0.01，圖4)。

圖4 各組DCs 上清液白介素12 分泌水平

5.HBeAg 對(duì)細(xì)胞活力的影響:1、2、5μg/ml HBeAg組細(xì)胞活力分別為85.20% ± 4.38%，84.80% ±3.19%和83.80% ±4.66%，4 組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＞0.05)，說明不同濃度HBeAg 作用下，DC 的細(xì)胞活力無明顯變化，提示HBeAg 并不會(huì)明顯降低細(xì)胞活力，對(duì)細(xì)胞無顯著毒性(圖5)。

討 論

圖5 不同劑量HBeAg 對(duì)DC 細(xì)胞活力的影響

雖然HBeAg 與病毒的組裝和復(fù)制均無關(guān)，但其在體內(nèi)乙肝病毒持續(xù)感染中發(fā)揮巨大作用，現(xiàn)已成為研究的熱點(diǎn)。已有的研究結(jié)果表明HBeAg 可導(dǎo)致慢性乙型肝炎患者外周血Th1/Th2 型細(xì)胞因子失衡，明顯抑制Th1 型細(xì)胞因子IFN -γ 的產(chǎn)生，促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子IL -10 和IL -6 的分泌，從而有利于形成對(duì)HBV 感染的免疫耐受［4，5］。近年來國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞在HBV 感染慢性化過程中也發(fā)揮重要作用。DC 作為機(jī)體重要的抗原遞呈細(xì)胞，廣泛分布于全身各器官。未成熟的DC 受到抗原刺激后，在攝取抗原并加工處理抗原過程中逐漸活化，高表達(dá)MHC-Ⅰ類/MHC -Ⅱ類分子和共刺激分子(CD80、CD86)，將處理后抗原遞呈給T 細(xì)胞使其活化增殖，產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞誘導(dǎo)免疫激活［6，7］。而慢性乙型肝炎患者外周血DC 表面共刺激分子的表達(dá)和炎性因子的分泌功能均下降，表現(xiàn)為成熟功能障礙，提示DC功能障礙與慢性乙肝免疫耐受有關(guān)。因此，本研究體外模擬樹突狀細(xì)胞生成和活化狀態(tài)，探討HBeAg 對(duì)樹突狀細(xì)胞表型、功能及細(xì)胞活力的影響，為進(jìn)一步明確慢性肝炎形成機(jī)制提供部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

CD11c 是小鼠骨髓源性DC 的特異性標(biāo)記。本研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg 共培養(yǎng)情況下，CD11c 陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯下降，說明HBeAg 降低了小鼠骨髓細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為樹突狀細(xì)胞的效率。而DC 產(chǎn)率的降低可能與NF-κB 信號(hào)通路的抑制有關(guān)。NF-κB 信號(hào)通路的活化在DC 的生成過程中發(fā)揮重要作用［8，9］。有研究發(fā)現(xiàn)HBeAg 可通過特異性地抑制含TIR 結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白Mal 和TRAM 參與的TLR 信號(hào)通道，進(jìn)而抑制TLR 通道介導(dǎo)的NF -κB 轉(zhuǎn)錄激活和隨后的生物學(xué)效應(yīng)［10］。

為了減少培養(yǎng)體系中其他細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)過CD11c 免疫磁珠分選純化后的DC 為研究對(duì)象。研究結(jié)果顯示單純HBeAg 作用下，DC 表面免疫分子的表達(dá)，促進(jìn)同種異體細(xì)胞增殖的能力及自發(fā)IL-12 分泌水平與空白對(duì)照組并無明顯差異。然而，HBeAg 卻可抑制LPS 引起的DC 表面MHC-Ⅱ和CD86 的表達(dá)，降低LPS 誘導(dǎo)增強(qiáng)的促同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力，說明HBeAg 有一定抑制樹突狀細(xì)胞成熟并影響其功能的作用。

在治療HBeAg 陽(yáng)性的CHB 患者時(shí)，實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換是重要的目標(biāo)。臨床數(shù)據(jù)顯示，IL -12的峰值出現(xiàn)在HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換前及轉(zhuǎn)換過程中，且較高的IL -12 水平與早期自發(fā)HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換有關(guān)。DC 是機(jī)體內(nèi)IL-12 的重要來源，IL-12 是一種重要的Th1 型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)因子。本研究發(fā)現(xiàn)HBeAg 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的DC 的IL-12 分泌有明顯下調(diào)作用，推斷HBeAg 可通過影響DC IL-12 的分泌，導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答無法有效激活，這可能也是導(dǎo)致HBV 感染慢性化的機(jī)制之一。

病毒和機(jī)體的相互作用是多方面的。以往關(guān)于CHB 的研究多著眼于效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞，對(duì)抗原遞呈細(xì)胞的研究相對(duì)較少，而僅僅針對(duì)一種免疫細(xì)胞的功能研究無法確切地揭示免疫狀態(tài)與CHB 的關(guān)系。本研究結(jié)果提示HBeAg 對(duì)樹突狀細(xì)胞并無明顯細(xì)胞毒性作用，可能通過抑制樹突狀細(xì)胞的生成和活化，使其無法發(fā)揮正常功能，進(jìn)而影響機(jī)體對(duì)抗原的識(shí)別及遞呈功能，最終導(dǎo)致機(jī)體特異性免疫應(yīng)答無法正常啟動(dòng)，這極可能與HBV 持續(xù)感染有關(guān)。但是有關(guān)HBeAg 干擾DC 的確切機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究，并且課題組也將在今后的臨床研究中探討慢性乙肝患者HBeAg 水平與機(jī)體DC 數(shù)量和功能的關(guān)系。

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