劉 鑫，周文紅，韋 海，劉慧霞

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004）

0 前言

普魯蘭多糖(Pullulan)是由多形態(tài)的真菌出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)利用蔗糖等作為碳源物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的一種線性胞外多糖[1]，它是由麥芽三糖通過(guò)α-1,6糖苷鍵連接而成的高分子多聚糖[2]。普魯蘭多糖無(wú)色無(wú)味，無(wú)毒無(wú)害，對(duì)人體無(wú)任何副作用，呈粉末狀，溶于水時(shí)散發(fā)出微微的甜味[3]。它含有豐富的羥基，極易溶于水，不溶于油脂、醇類、丙酮、醚和氯仿等有機(jī)溶劑[4]，并具有極佳的成膜性、氧氣不滲透性、耐熱性、耐酸堿性、成纖維性、粘結(jié)性、可塑性和易自然降解性等許多獨(dú)特的物理化學(xué)和生物化學(xué)特性[5]，可以廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥制造行業(yè)、食品工業(yè)、煙草工業(yè)、化妝品工業(yè)、農(nóng)業(yè)和污水處理等多種領(lǐng)域[6]，是一種具有極大經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值和巨大開發(fā)潛力的多功能新型生物產(chǎn)品[7]。

廣西是中國(guó)的產(chǎn)糖大省，擁有豐富的用于微生物發(fā)酵的碳源，其中作為加工精糖的原料原糖，是石灰法糖廠的特有產(chǎn)品[8]。目前，國(guó)內(nèi)外利用原糖進(jìn)行普魯蘭多糖的發(fā)酵還未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要初步探討原糖、白砂糖、葡萄糖、淀粉等不同碳源作為底物對(duì)出芽短梗霉As.40239進(jìn)行發(fā)酵合成并提取普魯蘭多糖，并進(jìn)行了原糖發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌種和原料

出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans 40329)：工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；實(shí)驗(yàn)所用的原糖采自廣西某精煉糖廠，白砂糖采自某亞硫酸法糖廠。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30，磷酸氫二鉀5，氯化鈉1，硫酸鎂0.2，硫酸銨0.6，酵母膏2.5，瓊脂20，氯霉素1，pH自然條件；種子培養(yǎng)基(g/L)：磷酸氫二鉀6，磷酸二氫鉀2，硝酸鈉1.54，氯化鈉2，七水硫酸鎂0.04，四水氯化錳0.006，六水氯化鐵0.002，鹽酸硫胺素0.004，葡萄糖30，酵母膏1，pH自然條件；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：磷酸氫二鉀6.5，硫酸銨0.4，氯化鈉1，硫酸鎂 0.1，酵母膏2.5，蔗糖50，搖瓶條件下初始pH為5.8。

1.2.2 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)：將保藏的斜面菌種接種至斜面培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)48 h，用于菌種活化；種子液培養(yǎng)：將活化的斜面菌種接入到裝有40 mL發(fā)酵液的250 mL三角瓶中，28℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h；發(fā)酵培養(yǎng)：采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方式，將種子培養(yǎng)液按照2%(v/v)的接種量接入到裝有50 mL發(fā)酵液的250 mL三角瓶中，28℃、200 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96 h。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 出芽短梗霉發(fā)酵

根據(jù)廣西制糖產(chǎn)業(yè)特色，選取精煉糖廠生產(chǎn)的原糖和亞硫酸法糖廠生產(chǎn)的白砂糖作為發(fā)酵底物碳源，另選擇葡萄糖和淀粉作為對(duì)比發(fā)酵的碳源，底物碳源采用5%反應(yīng)量。將保存的出芽短梗霉菌種斜面活化，28℃下培養(yǎng)48 h，此時(shí)菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；隨后按照2%的接種量接入250 mL（裝液量40 mL）的液體種子培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min，搖瓶發(fā)酵96 h。

2.2 普魯蘭多糖的提取

首先將搖瓶發(fā)酵96 h的發(fā)酵液4000 r/min下離心15 min，取離心后的上清液20 mL，加入2倍體積酒精，放置冰箱中 4℃過(guò)夜，使普魯蘭多糖盡可能全部析出于酒精中[9]；然后用玻璃棒將充分析出的普魯蘭多糖挑出，殘留的普魯蘭多糖在4000 r/min下離心15 min后一并移出；最后將普魯蘭多糖置于真空干燥箱中低溫干燥，防止普魯蘭多糖高溫干燥過(guò)程中氧化變色，干燥后的普魯蘭多糖進(jìn)行稱量。

2.3 普魯蘭多糖的純化

上述方法提取的為普魯蘭粗多糖，其中普魯蘭多糖的含量大約95%以上。粗普魯蘭多糖中存在一些雜質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、菌體等[10]，因此要進(jìn)一步提純。

普魯蘭多糖提純[11]過(guò)程：首先進(jìn)行熱處理，將發(fā)酵液4000 r/min離心15 min，取上清液，用碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到中性，80℃下水浴20 min后再次離心；然后向熱處理后的上清液中加入0.6%的活性炭脫色，200 r/min振蕩20 min，脫色后4000 r/min離心15 min，除去活性炭；接著用 2倍體積的有機(jī)溶劑丙酮沉淀多糖，放置冰箱中 4℃過(guò)夜，使普魯蘭多糖盡可能全部析出；析出后的多糖再用95%乙醇洗滌多糖2次后離心；最后將普魯蘭多糖置于真空干燥箱中低溫干燥，干燥后的普魯蘭多糖粉碎即可獲得較純的普魯蘭多糖粉末。

2.4 發(fā)酵后期各糖分的測(cè)定

2.4.1 總糖的測(cè)定

硫酸-苯酚法[12]測(cè)定總糖含量：在濃硫酸的作用下，多糖能夠水解成單糖，并通過(guò)脫水反應(yīng)生成糖醛衍生物，其與苯酚反應(yīng)生成顏色穩(wěn)定的橙黃色化合物，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)490 nm處，一定濃度范圍內(nèi)，吸光度和糖的含量呈線性關(guān)系，利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及其測(cè)定的吸光度值，即可計(jì)算出總糖的含量；

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制需要配制100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、6%苯酚溶液。

按照表1加入相應(yīng)的葡萄糖溶液、蒸餾水，以及6%苯酚1 mL、濃硫酸1 mL，搖勻振蕩充分后靜置20 min，490 nm處測(cè)定吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

取發(fā)酵液1 mL，加入蒸餾水稀釋100倍。取稀釋液1 mL于試管中，加入蒸餾水1 mL，6%苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL，搖勻振蕩充分后靜置20 min，490 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出總糖量。

總糖含量：

其中：X為發(fā)酵液總糖含量(g/L)；A為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品總糖含量(g/L)；C為發(fā)酵液總體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；V為測(cè)定時(shí)發(fā)酵液體積(mL)。本實(shí)驗(yàn)中：N=1000，V=1 mL，C=1 mL，A=x/1000。

2.4.2 殘?zhí)堑臏y(cè)定[13]

發(fā)酵后培養(yǎng)基中殘?zhí)橇?總糖量－多糖量

2.4.3 菌體消耗糖的量[13]

菌體發(fā)酵過(guò)程中，糖分參與代謝并提供發(fā)酵所需的能量。

菌體消耗糖的量=碳源量－總糖量

2.4.4 多糖轉(zhuǎn)化率[13]

3 結(jié)果與分析

3.1 不同底物碳源對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響

采用原糖、白砂糖、葡萄糖、淀粉作為發(fā)酵底物碳源，經(jīng)過(guò)發(fā)酵提取多糖后稱取多糖產(chǎn)量（每升發(fā)酵液產(chǎn)普魯蘭多糖的克數(shù)）和產(chǎn)物照片如圖2所示。

由圖2分析可知，在4種碳源添加量相同的情況下，原糖發(fā)酵生產(chǎn)的普魯蘭多糖產(chǎn)量要比蔗糖、葡萄糖和淀粉高出16%～53%，且原糖發(fā)酵合成普魯蘭多糖的過(guò)程中黑色素產(chǎn)生最少，多糖顏色較淺。分析原因應(yīng)該從糖代謝角度進(jìn)行，普魯蘭前體起源于尿苷二磷酸葡萄糖，而且在其生物合成的過(guò)程中，有3種關(guān)鍵性的代謝酶：α-磷酸葡萄糖變位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[14]，有些二價(jià)金屬元素又可以作為這幾種關(guān)鍵酶的激活劑，原糖中含有少量多酚類物質(zhì)、還原糖、糖蜜、金屬元素形成的膠體物質(zhì)等[8]，原糖中含有的雜質(zhì)以及二價(jià)金屬元素可能對(duì)菌種細(xì)胞中糖代謝關(guān)鍵酶的調(diào)控具有激活劑的作用，對(duì)菌種發(fā)酵后期黑色素產(chǎn)生也具有抑制作用。

淀粉發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖產(chǎn)量最低，僅5.38 g/L，在發(fā)酵后期，搖瓶底部還殘留大量未參與反應(yīng)的淀粉。分析原因可能是由于淀粉在參與出芽短梗霉代謝過(guò)程中，要先水解成小分子糖類，然后才能進(jìn)入糖代謝過(guò)程，致使發(fā)酵過(guò)程緩慢，從而使得普魯蘭產(chǎn)量偏低。在發(fā)酵結(jié)束后，由于發(fā)酵液中殘留的淀粉，使得普魯蘭多糖分離困難，提純難度大。

圖2 不同碳源對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響

3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

影響普魯蘭多糖的產(chǎn)量的主要培養(yǎng)基成分有 3種，分別是磷酸氫二鉀、硫酸銨、酵母膏?，F(xiàn)采用原糖作為碳源，通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。正交試驗(yàn)因素水平如表2所示，正交試驗(yàn)結(jié)果如表3和表4所示。

采用IBM SPSS Statistics軟件對(duì)表3和表4的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。可以看出，如果P<0.05，則為差異顯著。

再通過(guò)F檢驗(yàn)分析判斷，給定顯著水平α=2.5%，查得F0.025(2,8)=6.06。對(duì)比F值，可以看出A不顯著，B、C極顯著?？傊ㄟ^(guò)方差分析得出，硫酸銨和酵母膏對(duì)多糖產(chǎn)量的影響極為顯著。說(shuō)明氮源在提高多糖產(chǎn)量中具有重要的作用。

3.3 發(fā)酵液中各糖分的測(cè)定及分析

采用硫酸-苯酚法測(cè)定上述正交試驗(yàn)中總糖含量，進(jìn)一步計(jì)算出殘?zhí)呛恳约熬w發(fā)酵過(guò)程中參與代謝和維持能力所消耗的糖含量。最終計(jì)算結(jié)果見表6。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 試驗(yàn)分析表

表5 各因素對(duì)多糖產(chǎn)量影響的方差分析表

表6 普魯蘭多糖各項(xiàng)數(shù)據(jù)值

從表6以及正交實(shí)驗(yàn)表3和表4可以看到，9組正交試驗(yàn)的不同發(fā)酵條件的組合，除了第4組和第7組外，其他各組當(dāng)菌種產(chǎn)量增加的同時(shí)，菌種消耗量也增加了。不僅抑制了多糖的轉(zhuǎn)化，同時(shí)菌種的代謝也會(huì)消耗多糖。只有第4組和第7組多糖產(chǎn)量相比其它各組要高一些，分別為12.16 g/L和12.27 g/L。通過(guò)第4組和第7組培養(yǎng)基對(duì)比可知，第7組殘?zhí)橇孔畹?，?3.01 g/L，印證了第7組菌體代謝消耗糖的量較高，且菌種產(chǎn)量遠(yuǎn)高于第4組。比較2組可知，第7組培養(yǎng)基的組合更利于菌體生長(zhǎng)，說(shuō)明磷酸二氫鉀和酵母膏含量高不僅有利于多糖生長(zhǎng)，同時(shí)有利于菌體生長(zhǎng)。在第4組和第7組產(chǎn)多糖差不多的條件下，優(yōu)選第4組培養(yǎng)基配方。

根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組多糖顏色的比較，可以認(rèn)為有機(jī)氮源酵母膏的含量對(duì)多糖顏色深淺影響較大。有機(jī)氮源添加量少，出芽短梗霉發(fā)酵后期產(chǎn)生色素多；反之，發(fā)酵后期產(chǎn)生色素少。尤其是第1、6、7組的結(jié)果更加印證了此結(jié)論?？傊?，酵母膏添加量不能太少也不宜過(guò)高，過(guò)高時(shí)有利于菌體的生長(zhǎng)，卻導(dǎo)致多糖產(chǎn)量的降低；酵母膏添加量也不易過(guò)低，過(guò)低導(dǎo)致黑色素產(chǎn)生過(guò)多。綜上分析的結(jié)論與正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合方案相一致。

驗(yàn)證試驗(yàn)：在正交試驗(yàn)最佳組合 A3B1C2下進(jìn)行發(fā)酵，做了3組平行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)果如表7所示：

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)

4 結(jié)語(yǔ)

選擇原糖作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖可以節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本，發(fā)酵產(chǎn)生的普魯蘭多糖產(chǎn)量也相比其它碳源要高出16%～53%，同時(shí)原糖可以抑制菌體發(fā)酵后期黑色素的產(chǎn)生，使得產(chǎn)物普魯蘭多糖的色澤更白，更有利于普魯蘭多糖后期的提純。通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分磷酸二氫鉀、有機(jī)氮源酵母膏以及無(wú)機(jī)氮源硫酸銨進(jìn)行正交優(yōu)化，確定出最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在最適培養(yǎng)基的條件下，發(fā)酵生成的普魯蘭多糖產(chǎn)量可以達(dá)到12.39 g/L，多糖轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到26.65%。

在國(guó)內(nèi)，普魯蘭多糖的開發(fā)與應(yīng)用還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，相比國(guó)外尤其是日本大規(guī)模的生產(chǎn)和壟斷還有較大的差距，使得普魯蘭多糖的市場(chǎng)價(jià)格在 150元/kg[15]。而普魯蘭多糖獨(dú)特的性質(zhì)以及在食品、醫(yī)藥、日用化工、建材、環(huán)保等眾多領(lǐng)域上的應(yīng)用，使其開發(fā)和生產(chǎn)的價(jià)值更具有較大的前景[16]。廣西作為中國(guó)的產(chǎn)糖大省，具有豐富的發(fā)酵普魯蘭多糖的原料，開發(fā)新型多功能普魯蘭多糖的產(chǎn)業(yè)鏈，對(duì)廣西制糖產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型具有一定的指導(dǎo)意義。

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