牛國(guó)敏，張復(fù)華，楊國(guó)雷，凌奕文，潘煥玉，徐嘉愉

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院，廣東 佛山 528200）

急性白血病是血液系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性疾病，自然病程短，死亡率高，近年來(lái)隨著化療方案的不斷改進(jìn)，緩解率有很大提高，但仍有部分患者不能緩解或緩解后很快復(fù)發(fā)。白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥是化療失敗的主要原因。環(huán)氧化酶－2（Cyclooxygense－2，Cox－2）是前列腺素合成過(guò)程中的重要限速酶［1］，在多種腫瘤包括急性白血病中表達(dá)異常增高［2－3］，通過(guò)多種途徑參與白血病的發(fā)生發(fā)展。有研究表明Cox－2與惡性腫瘤耐藥有關(guān)。槲皮素（Quercetin，Que）是自然界常見(jiàn)的植物黃酮類(lèi)化合物，通過(guò)抑制Cox－2的表達(dá)誘導(dǎo)急性白血病細(xì)胞凋亡［4］。那么槲皮素是否可以同樣抑制急性白血病耐藥細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制是否與Cox－2有關(guān)，本研究通過(guò)觀(guān)察槲皮素處理后Cox－2的表達(dá)水平來(lái)探討Cox－2在急性白血病細(xì)胞耐藥中的作用。

1 材料和方法

1.1 槲皮素 槲皮素（sigma公司）用二甲亞砜（DMSO）溶解，濃度為100mmol／L，－20 ℃低溫保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 耐藥白血病細(xì)胞株HL－60、HL－60A 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，本實(shí)驗(yàn)室冷凍保存。復(fù)蘇的HL－60細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（杭州四季青 中國(guó)）、3%谷氨酰胺的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d傳代換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononu－clear cells，PBMC）的提取 無(wú)菌操作抽取正常成人新鮮離體的靜脈全血，EDTA 抗凝后將細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液上，離心后吸出血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界面的外周血單個(gè)核細(xì)胞。

1.4 CCK－8 法檢測(cè)槲皮素對(duì)HL－60、HL－60A細(xì)胞增殖的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL－60 及HL－60A 細(xì)胞，據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)槲皮素終濃度為0、25、50、100μmol／L，分別加入不同濃度的槲皮素孵育48 h后，再加入CCK－8試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)，取三個(gè)復(fù)孔的平均吸光度值作為該濃度條件下的OD 值。細(xì)胞存活率（%）＝（處理組OD 值／對(duì)照組OD 值）×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀AnnexinV－FITC／PI染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞 取終濃度為0、25﹑50﹑100μmol／L 的槲皮素作用48h后的HL－60及HL－60A 細(xì)胞，加入5μl AnnexinV－FITC和2.5μl PI。避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。早期凋亡細(xì)胞AnnexinV－FITC（＋）PI（－），晚期凋亡細(xì)胞AnnexinV－FITC（＋）PI（＋）。

1.6 Western－blot檢測(cè)細(xì)胞Cox－2蛋白的表達(dá) 取終濃度為0、25﹑50﹑100μmol／L槲皮素作用48 h后的HL－60及HL－60A 細(xì)胞，洗凈后于冰上加入RIPA 裂解液，冰上充分裂解30min后4℃12 000r／min離心收集上清，行SDS－PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用相應(yīng)的抗體雜交后加入HRP（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的二抗，以DAB 顯色。用Actin作為內(nèi)參對(duì)照以確定加載的蛋白量相等。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK－8法分析槲皮素對(duì)HL－60及HL－60A細(xì)胞毒性作用 用CCK－8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，分析槲皮素的細(xì)胞毒性作用，結(jié)果顯示，用濃度為0～100 μmol／L的槲皮素分別孵育HL－60及HL－60A 細(xì)胞48h后，細(xì)胞存活率逐漸下降，對(duì)HL－60細(xì)胞毒性作用更明顯，其半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration 50，IC50）值 為 分 別 為61.14 μmol／L、80.56 μmol／L，結(jié)果提示槲皮素不僅能抑制HL－60細(xì)胞生長(zhǎng)，還能抑制其耐藥細(xì)胞HL－60A 的生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

圖1 槲皮素對(duì)HL－60及HL－60A 的毒性作用

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 槲皮素作用HL－60及HL－60A 細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以誘導(dǎo)HL－60及HL－60A 細(xì)胞凋亡，并隨著藥物濃度的增高，凋亡率逐漸增加，見(jiàn)表1。

表1 槲皮素誘導(dǎo)HL－60／HL－60A的細(xì)胞凋亡率 （±s，%）

表1 槲皮素誘導(dǎo)HL－60／HL－60A的細(xì)胞凋亡率 （±s，%）

注：與對(duì)照組比較，a：P ＜0.05

組別 HL－60 HL－60A對(duì)照組 2.24±1.37 1.52±1.11槲皮素處理組（μmol／L） 25 8.79±1.01a 6.37±0.82a 50 16.88±0.89a 14.10±1.29a 100 21.23±0.95a 18.31±0.89a

2.3 正常人PBMC和HL－60、HL－60A 的Cox－2蛋白表達(dá)水平 正常人外周血中提取單個(gè)核細(xì)胞用來(lái)檢測(cè)Cox－2蛋白的表達(dá)，并與人白血病細(xì)胞株HL－60和HL－60A 對(duì)比。結(jié)果顯示：正常人Cox－2的表達(dá)量低，HL－60及HL－60A 的表達(dá)顯著升高，HL－60A 中Cox－2表達(dá)是HL－60的1.52倍。見(jiàn)圖2。

圖2 Cox－2蛋白在正常人PBMC、HL－60、HL－60A 的表達(dá)

2.4 槲皮素對(duì)HL－60、HL－60A 細(xì)胞Cox－2蛋白表達(dá)的影響 槲皮素處理HL－60細(xì)胞48h后，隨著槲皮素濃度的升高，Cox－2蛋白表達(dá)水平下降；HL－60A 細(xì)胞有相同的趨勢(shì)，而且相同槲皮素濃度作用后HL－60A 細(xì)胞Cox－2蛋白下降更為明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 槲皮素對(duì)HL－60、HL－60A細(xì)胞Cox－2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

作為自然界分布最廣泛的黃酮類(lèi)化合物，槲皮素具有抗氧化、抗過(guò)敏、抗血栓及保護(hù)神經(jīng)等藥理作用［5］，而其抑制包括急性白血病在內(nèi)多種腫瘤生長(zhǎng)的作用也得到廣泛的證實(shí)［6］。本研究證實(shí)槲皮素不僅可以抑制急性白血病細(xì)胞株HL－60的生長(zhǎng)，還可抑制耐藥細(xì)胞株HL－60A 的生長(zhǎng)。HL－60A 細(xì)胞株耐藥的主要原因?yàn)楦弑磉_(dá)以P－糖蛋白（P－gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP1）等為代表的ATP（adenosine triphosphate）結(jié)合膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們利用ATP水解釋放的能量將藥物泵出細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度減低而導(dǎo)致耐藥。蔡訊等［7－8］的一系列研究表明低劑量槲皮素可以抑制P－gp和MPR1的外流泵功能達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的目的。本研究采用CCK－8 法測(cè)定槲皮素對(duì)HL－60及HL－60A 的毒性作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IC50值分別為61.14μmol／L、80.56μmol／L；相對(duì)于需要數(shù)倍于原有劑量才可以對(duì)耐藥細(xì)胞產(chǎn)生相同殺傷作用的細(xì)胞毒藥物來(lái)講，槲皮素僅輕度提高劑量就可以對(duì)耐藥細(xì)胞株發(fā)揮相似的殺傷效應(yīng)，提示槲皮素可以直接抑制HL－60A 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。

細(xì)胞凋亡（cell apoptosis）又被稱(chēng)為程序化細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD）在正常機(jī)體受到嚴(yán)密調(diào)控，而細(xì)胞凋亡異常的發(fā)生幾乎貫穿惡性腫瘤發(fā)病的整個(gè)過(guò)程［9］。針對(duì)凋亡異常采取誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物治療或基因治療可以直接殺傷異常腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞損害小。本研究流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制HL－60及HL60A 細(xì)胞增殖。Cox－2與急性白血病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。許多血液腫瘤的原代細(xì)胞和細(xì)胞株（如急性髓系白血病、急性單核細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤等）均有Cox－2的高表達(dá)［10－11］。Cox－2的表達(dá)量與一些血液系統(tǒng)腫瘤的臨床預(yù)后密切相關(guān)，被認(rèn)為是影響預(yù)后因素的獨(dú)立指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)Cox－2不僅在HL－60細(xì)胞高表達(dá)，而且在HL－60A 細(xì)胞表達(dá)進(jìn)一步增高；而且經(jīng)槲皮素處理后HL－60A 細(xì)胞Cox－2的表達(dá)下降較HL－60細(xì)胞更加顯著。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)槲皮素通過(guò)抑制Cox－2的表達(dá)降低Bcl－2的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)Bax的表達(dá)，啟動(dòng)Caspase－3級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡。因此，我們推測(cè)槲皮素亦可能通過(guò)抑制Cox－2的表達(dá)啟動(dòng)級(jí)聯(lián)凋亡效應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制HL－60A 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。由于槲皮素抑制HL－60A 細(xì)胞Cox－2表達(dá)較HL－60細(xì)胞更加顯著，推測(cè)Cox－2在槲皮素抑制HL－60A 細(xì)胞增殖過(guò)程中起到了更加重要的作用。

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