覃彥平，曹昭，覃錦耀，林觀鳳，吳君榮

（1.廣西柳州市紅十字會醫(yī)院檢驗科，廣西 柳州 545001 E－mail：1227143070＠qq.com；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 南寧 530021；3.廣西柳州市紅十字會醫(yī)院放射科，廣西 柳州 545001）

肝癌是廣西常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率、致死率極高。手術(shù)治療是常用的根治性治療方法，但術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)是影響患者長期生存的關(guān)鍵因素。研究者已發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素－23受體（interleukin－23receptor；IL－23R）基因單核苷酸多態(tài)性與肝癌發(fā)病相關(guān)［1－4］，然而IL－23R 基因單核苷酸多態(tài)性對肝癌預(yù)后作用的相關(guān)研究未見報道。因此，本課題組針對68例手術(shù)治療的肝 癌 患 者 進(jìn) 行IL－23R 基 因rs17375018 及rs11805303位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與預(yù)后關(guān)系的研究，探討IL－23R 基因?qū)Ω伟╊A(yù)后的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究對象均為2012年7～12月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的未經(jīng)化療、放療的廣西地區(qū)肝癌手術(shù)治療患者。入選對象均為根據(jù)患者病史及臨床表現(xiàn)，CT、MRI等影像學(xué)檢查結(jié)果陽性，或血清AFP＞400μg／L，或肝臟細(xì)胞學(xué)檢查及腫瘤標(biāo)本病理診斷符合原發(fā)性肝癌的患者。其中，68例有完整隨訪資料的患者納入本研究。男58例，女10例，年齡24～69歲，平均年齡（46.4±11.4）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 提取DNA 抽取患者靜脈血2 ml并用EDTA 抗凝，采用苯酚－氯仿法提取DNA 后置于－20℃冰箱備測。

1.2.2 采用PCR－RFLP 方法檢查基因型 引物由上海生工生物科技有限公司合成，rs17375018位點(diǎn)引物序列上游為：5 ˊ－AGTAATTATTCTAGTTGATAACT－3ˊ，下游為：5 ˊ－ AATAAAAGTGAATGTTCTCCTCT－3ˊ；rs11805303位點(diǎn)引物序 列 上 游 為：5 ˊ－TATGCTTGAAACAGAGAACTGTTTCTT－3ˊ，下游為：5ˊ－CACAGAATACTTAAATTTTTTATCC－3 ˊ。采用DA－7300PCR 分析儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為25μl，包括基因組DNA 2.0μl，兩種引物（1.0μmol／L）各1μl，Dream TaqTM Green PCR Master Mix（2x）12.5μl，余用滅菌去離子水補(bǔ)足。兩個位點(diǎn)PCR 反應(yīng)循 環(huán)參數(shù) 一致：95 ℃預(yù) 變 性2 min，95 ℃變性20s，52 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，35個循環(huán)，72℃延伸10min。采用Fermentas公司生產(chǎn)的PCR 反應(yīng)試劑及限制性內(nèi)切酶。酶切反應(yīng)體系為：PCR 產(chǎn)物10μl，限制性內(nèi)切酶（10U／μl）1μl，反應(yīng)緩沖液2μl，余用滅菌去離子水補(bǔ)足，37 ℃酶切過夜。內(nèi)切酶分別為Hae3和Dra1。將酶切產(chǎn)物與DNA marker 同步瓊脂糖凝膠電泳，觀察基因型。

1.2.3 DNA 測序 由上海生工生物有限公司進(jìn)行抽樣測序驗證，酶切結(jié)果與測序結(jié)果相吻合。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 基因型頻率及生存率采用直接計數(shù)法統(tǒng)計。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率法。所有統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件處理，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

肝癌根治術(shù)后患者IL－23R 基因rs17375018及rs11805303位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性分布頻率及生存率詳見表1。rs17375018 位點(diǎn)在年齡、性別、病理組織學(xué)、復(fù)發(fā)及存活與否分組間的分布頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.0 5）；rs11805303位點(diǎn)除了在男女性別間多態(tài)性分布頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）外，其它各組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 IL－23R 基因SNP與肝癌根治術(shù)后患者各臨床參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)許多患者發(fā)病基礎(chǔ)以及治療條件相似，但由于患者個體基因多態(tài)性的差異性導(dǎo)致疾病預(yù)后各不相同［5］?；蚨鄳B(tài)性不僅與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，還影響治療后的疾病復(fù)發(fā)率、生存率。炎性細(xì)胞因子IL－23R 為膜表面蛋白受體，屬于促紅細(xì)胞生成素受體超家族成員，是IL－23 受體復(fù)合物的一個亞基。IL－23R 與多種免疫性疾病、癌癥等的發(fā)病有關(guān)［4－8］，其作用是IL－23發(fā)揮其生物學(xué)效用的傳導(dǎo)器。IL－23在肝癌組織中顯著高表達(dá)，并參與肝癌血管的形成［9］。IL－23R 還能誘導(dǎo)TH 細(xì)胞分化，促使IL－17、IL－10等炎性細(xì)胞因子的大量分泌［10］。其中IL－17 可促進(jìn)肝癌血管生長致使腫瘤向肝外器官侵襲［11］，且與術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)［12］；IL－10則可參與大鼠肝癌免疫微環(huán)境的免疫抑制調(diào)節(jié)作用［13］。

本課題組前期已對IL－23R 基因單核苷酸多態(tài)性與肝癌的相關(guān)性進(jìn)行了研究［2－4］，本次在前期研究的基礎(chǔ)上針對其中的68例肝癌根治術(shù)后患者分析其預(yù)后與IL－23R 基因單核苷酸多態(tài)性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IL－23R 基因rs17375018及rs11805303位點(diǎn)基因單核苷酸多態(tài)性頻率分布與年齡、病理組織學(xué)分級、復(fù)發(fā)及存活與否均無關(guān)；在性別組間rs17375018位點(diǎn)多態(tài)性頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），rs11805303位點(diǎn)則反之，男性患者CT 型占多數(shù)，女性患者為CC型最多。68例患者中3例死于復(fù)發(fā)，均為男性。其中rs17375018位點(diǎn)攜帶GG 型者2例，GA 型者1例；全部為rs11805303位點(diǎn)攜帶CT 型者；病理組織學(xué)分級則為Ⅲ＋Ⅳ級2例，Ⅰ＋Ⅱ級1例。12例復(fù)發(fā)后存活，以rs17375018位點(diǎn)攜帶GG 型及rs11805303位點(diǎn)攜帶CT 型者復(fù)發(fā)率高。53 例存活且無復(fù)發(fā)，rs17375018位點(diǎn)攜帶AG 型存活且無復(fù)發(fā)肝癌患者25例，較攜帶GG 或AA 型者多；與攜帶CC 或TT 型者比較，rs11805303位點(diǎn)攜帶CT 型存活且無復(fù)發(fā)肝癌患者最多，為28例。攜帶rs17375018位點(diǎn)GG 型及rs11805303位點(diǎn)CT 型肝癌患者的18個月生存率最低，分別為93.75%和91.67%。

總之，本次對廣西肝癌人群IL－23R 基因單核苷酸多態(tài)性與肝癌根治術(shù)后患者預(yù)后的研究證實了IL－23R 基因單核苷酸多態(tài)性與術(shù)后患者生存狀況可能無關(guān)。由于樣本量、不同種族或人群地域差異等因素不同都會影響研究結(jié)果。因此，要全面了解IL－23R基因單核苷酸多態(tài)性對肝癌預(yù)后的影響，尚需進(jìn)行不同人群、大樣本的研究。

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