江旭鋒，曾慶春，劉軍杰，曾怡，蘇莉莉，黃岑漢，劉燕平②

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001 E－mail：1536673698＠qq.com；2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

糖尿病腎?。―N）以腎小球基底膜（GBM）增厚、系膜增生為主要病理特征，從而導(dǎo)致腎小球硬化，并出現(xiàn)蛋白尿，甚至腎功能衰竭［1－3］。而結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF－β1）、血漿纖溶酶原激活物抑制物（PAI－1）、纖維連接蛋白（FN）是DN病理過(guò)程中的重要細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)DN 的病理改變。壯通飲（ZTY）為治療DN 的經(jīng)驗(yàn)方［4］，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量RT－PCR 法檢測(cè)壯通飲對(duì)DN 大鼠腎皮質(zhì)CTGF、TGF－β1、PAI－1、FN 細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響，以進(jìn)一步研究其保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)純種SD 大鼠140只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，鼠齡4 個(gè)月，檢疫合格，血糖正常，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（合格證編號(hào)：SCXK 桂2009－000），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品和試劑 水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20130513）；鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：90513038）；ZTY 水煎液（扶芳藤、黃花倒水蓮、參三七），購(gòu)自廣西柳州百草堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20131023；卡托普利片（廣東臺(tái)城制藥股份有限公司，批號(hào)：20130302）；目測(cè)尿蛋白試紙（廣州市花都高爾寶生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20130717）；總RNA 提取試 劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，Code No.9767）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Perfect Real Time，Code No.RR047A）、實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR 試劑盒（TaKaRa SYBR?R Premix Ex TaqTMII TLi RNaseH Plus，Code No.RR820A），均購(gòu)自于大連寶生物有限公司；引物由廣州吉格生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 儀器 超低溫冰箱（日本SANYO 公司，型號(hào)：MDF－u72v）、制冰機(jī)（日本SANYO 公司，型號(hào)：SIM－F124）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：BS223S）、旋窩混合器（上海琪特分析儀器有限公司，型號(hào)：XW－80A）、電腦三恒電泳儀（北京市六一儀器廠，型號(hào)：DYY－6D）、超微量分光光度計(jì)（德國(guó)IMPLEN 公司，型號(hào)：Nanophtoometer Pearl360）、高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司，型號(hào)：1－14K）、干式恒溫器（杭州瑞成儀器有限公司，型號(hào)：DC10）、普通梯度PCR 儀（美國(guó)BIO－RAO 公司，型號(hào)：PTC－200）、Real Time PCR 儀（美國(guó)BIO－RAO 公司，型號(hào)：CFX96）、安穩(wěn)血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO－RAO 公司，型號(hào)：Gel－Doc 2000）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備及分組給藥 將140只SPF級(jí)純種SD 大鼠給予普通飼料、自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)取10只為空白對(duì)照組，20只為假手術(shù)組，其余為造模組。參照模型制備和成模標(biāo)準(zhǔn)［5］，將假手術(shù)組與造模組皆以10%水合氯醛3.0 ml／kg腹腔注射麻醉，但假手術(shù)組僅切開(kāi)皮層、肌層，不切除腎臟并縫合，而造模組結(jié)扎左腎門(mén)血管行左腎切除術(shù)并縫合，且造模組于術(shù)后恢復(fù)2周后，禁食12h，以2%STZ 溶液50mg／kg，一次性腹腔注射造模。72h后測(cè)尾靜脈血糖，其值≥16.7 mmol／l即為造模成功。之后繼續(xù)飼養(yǎng)1個(gè)月，造模組微量白蛋白＞30mg／d后，隨機(jī)取30只為模型組，其余各治療組（西藥組和ZTY 低、中、高劑量組）各20 只。各治療組大鼠每日灌胃量為：ZTY 各組用ZTY 水煎液（低劑量組6.8g／kg，中劑量組13.6g／kg，高劑量組27.2g／kg），西藥組用卡托普利液（10 mg／kg）。模型對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠：用0.5%CMC－Na，按100g／ml大鼠體質(zhì)量與灌胃體積比灌胃?？瞻捉M不予處理。各組大鼠自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食，每天9：00～10：00一次性灌胃，連續(xù)灌胃用藥6周。末次給藥后，禁食（不禁水）10h，行10%水合氯醛3.5g／kg腹腔注射麻醉，取出右腎，剝離被膜，每組各隨機(jī)取3只大鼠的50%腎臟用凍存管，以液氮短暫保存，然后轉(zhuǎn)移到－80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 熒光實(shí)時(shí)定量RT－PCR 法檢測(cè) 取大鼠腎皮質(zhì)組織，液氮研磨后，按試劑盒方法提取腎皮質(zhì)總RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度和純度，電泳RNA 完整性。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 在－20℃水箱保存，用于熒光實(shí)時(shí)定量RT－PCR 檢測(cè)。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)參考核苷酸序列，用Prime3.0軟件設(shè)計(jì)目的基因引物，引物序列經(jīng)NCBI nBlast比對(duì)無(wú)非特異性擴(kuò)增，用于RT－PCR 實(shí)驗(yàn)，引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

冰上配制RT－PCR 反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10μl，正反引物各0.8μl，cDNA 模板2μl，加dH2O 至總反應(yīng)體系20μl。擴(kuò)增條件：95 ℃10min，95 ℃10s，60 ℃20s，72 ℃30s，共44個(gè)循環(huán)。融解曲線分析：72～94 ℃，每個(gè)循環(huán)增加0.4 ℃，持續(xù)0.05s。以GAPDH 作為內(nèi)參，用熒光相對(duì)定量分析2－△△CT法來(lái)表示目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，具體如下：①將對(duì)照樣品和檢測(cè)樣品的目的基因和內(nèi)參基因的CT值進(jìn)行均一化處理：△CT（對(duì)照樣品）＝CT（目的基因）－ CT（內(nèi)參基因）；△CT（檢測(cè)樣品）＝CT（目的基因）－ CT（內(nèi)參基因）。②將對(duì)照樣品和檢測(cè)樣品的△CT值進(jìn)行均一化處理：△△CT＝△CT（檢測(cè)樣品）－△CT（對(duì)照樣品）。③計(jì)算相對(duì)表達(dá)量：即2－△△CT。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組計(jì)量資料采用ANOVA 檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)的兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

各組大鼠經(jīng)3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，結(jié)果見(jiàn)表2、圖1～4。與空白組相比，假手術(shù)組的各細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組及各治療組的各細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)均升高（P ＜0.05）；與模型組相比，西藥組與ZTY 低、中、高各組細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)均降低（P ＜0.05）。表明各治療組均可以降低DN 大鼠腎皮質(zhì)CTGF、TGF－β1、PAI－1、FN 細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)，其中ZTY 中劑量組降低最為明顯。

表2 ZTY 對(duì)DN 大鼠CTGF、TGF－β1、PAI－1、FN 細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響 （±s）

表2 ZTY 對(duì)DN 大鼠CTGF、TGF－β1、PAI－1、FN 細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響 （±s）

注：與空白組相比較，a：P ＜0.05；與模型組相比較，b：P ＜0.05

組別 CTGF TGF－β1 PAI－1 FN空白組 1.015±0.078b 1.033±0.055b 1.007±0.021b 1.002±0.081b假手術(shù)組 1.183±0.094b 1.268±0.107b 0.830±0.143b 2.777±0.120b模型組 19.895±0.869a 3.459±0.922a 19.072±2.264a 11.543±0.082a西藥組 3.438±0.021ab 1.895±0.021ab 4.723±0.485ab 3.671±0.519ab ZTY 低劑量組 9.819±2.936ab 2.364±0.317ab 12.015±0.695ab 5.241±1.435ab ZTY 中劑量組 3.198±0.680ab 1.798±0.107ab 4.625±0.737ab 3.506±0.557ab ZTY 高劑量組 12.069±0.258ab 2.706±0.273ab 12.211±0.317ab 7.709±2.203ab

圖1 ZTY 對(duì)DN 大鼠腎皮質(zhì)CTGF細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響

圖2 ZTY 對(duì)DN 大鼠腎皮質(zhì)TGF－β1 細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響

圖3 ZTY 對(duì)DN 大鼠腎皮質(zhì)PAI－1細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響

圖4 ZTY 對(duì)DN 大鼠腎皮質(zhì)FN 細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響

4 討論

DN 是糖尿病最為常見(jiàn)的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一。近年的研究表明，細(xì)胞因子在DN 發(fā)生發(fā)展的病理改變中，起著重要作用。CTGF 是一種新的促纖維化生長(zhǎng)因子，是DN 發(fā)生的重要驅(qū)動(dòng)因子之一［6］。

Thomson SE 等［7］研 究 發(fā) 現(xiàn)，CTGF 可 使 腎 小 球系膜細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成增多，并可通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子－1（TIMP－1）抑制ECM的降解。而ECM 的過(guò)多積聚可以引起腎小球硬化、腎臟纖維化等［8］。

TGF－β1 是DN 病程進(jìn)展中重要的細(xì)胞因子，是導(dǎo)致ECM 過(guò)度沉積的關(guān)鍵因子，在腎小球持續(xù)表達(dá)可誘導(dǎo)包括系膜細(xì)胞在內(nèi)多種細(xì)胞基質(zhì)蛋白，如Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層黏連蛋白等異常增加［9－10］。TGF－β1 通過(guò)介導(dǎo)足細(xì)胞的損失、系膜細(xì)胞增生、內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移和凋亡，在DN 腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化中起關(guān)鍵作用［11］。

PAI－1是調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)生理功能的重要細(xì)胞因子，是纖溶酶原激活劑的主要抑制劑。Paueksakon P等［12］在DN 患者腎小球微血管損傷與PAI－1增強(qiáng)的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，腎小球Kimmelstiel－Wilson 結(jié)節(jié)硬化DN 患者的PAI－1染色增強(qiáng)。PAI－1可通過(guò)上調(diào)TGF－β1 增加ECM 合成，也可通過(guò)抑制纖溶酶活性和基質(zhì)蛋白酶2活性減少ECM 降解，從而使ECM沉積，導(dǎo)致腎小球硬化［13］。

FN 是ECM 的重要組成部分，目前認(rèn)為FN 異常增多在DN 發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［14］。在DN 中，F(xiàn)N 蛋白的過(guò)度產(chǎn)生可導(dǎo)致ECM 堆積和腎小球基膜（GBM）增厚，抑制FN 蛋白的過(guò)度產(chǎn)生可延緩DN 的病程［15］。

綜上，CTGF、TGF－β1、PAI－1、FN 各細(xì)胞因子可致DN 腎臟病理改變。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ZTY 可以調(diào)節(jié)DN 大鼠腎皮質(zhì)CTGF、TGF－β1、PAI－1、FN 細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)，以減輕腎臟病理改變，對(duì)DN大鼠的腎臟具有一定的保護(hù)作用。

［1］ 張雪濤.細(xì)胞外基質(zhì)增殖在糖尿病腎的作用［J］.中華腎病雜志，1997，13（5）：315－316.

［2］ Brito PL，F(xiàn)ioretto P，Drummund K，et al.Proximal tubμlar basement membrane width in insμlin－dependent diabetes mellitus［J］.Kidney International，1998，53（3）：754－761.

［3］ 莊祥云.糖尿病腎病的病理［J］.日本醫(yī)學(xué)介紹，1998，19（10）：467－468.

［4］ 劉燕平，黃岑漢.壯醫(yī)驗(yàn)方壯通飲組成藥物現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（6）：111－112.

［5］ 邢淑麗，鄭君芙，黃文政.單側(cè)腎切除STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠動(dòng)物模型研究［J］.中國(guó)中醫(yī)急診，2006，15（6）：643－644.

［6］ 周月宏，王秋月.CTGF在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用及意義［J］.國(guó)際內(nèi)分泌代謝 雜志，2006，26（4）：273－276.

［7］ Thomson SE，McLennan SV，Kirwan PD，et al.Renal connective tissue growth factor correlates with glomerular basement membrane thickness and prospective albuminuria in a non－h(huán)uman primate model of diabetes：possible predictive marker for incipient diabetic［J］.J Diabetes Complications，2008，22（4）：284－294.

［8］ 朱辟疆.細(xì)胞外基質(zhì)與腎小球硬化［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2000，1（2）：123－125.

［9］ 于倩，張沫，劉德敏.TGF－β1、CTGF基因的過(guò)表達(dá)與早期糖尿病腎病關(guān)系的研究［J］.天津醫(yī)藥，2012，40（3）：262－265.

［10］ 鄭景晨，倪連松，汪大望，等.糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞因子基因表達(dá)初步研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2004，20（1）：137－138.

［11］ 苗金紅，劉章鎖，婁小平，等.纈沙坦對(duì)糖尿病患者血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF－β1 水平的影響臨床觀察［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2014，35（10）：4－5.

［12］ Paueksakon P，Revelo MP，Ma LJ，et al.Microangiopathic injury and augmented PAI－1in human diabetic nephropathy［J］.Kidney International，2002，61（6）：2142－2148.

［13］ 高倩，王戰(zhàn)建.vWF、PAI－1與糖尿病腎病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2014，20（14）：2601－2604.

［14］ 傅曉駿，熊榮兵.黃芪水蛭制劑對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟組織中C－IV、FN 及IL－1β表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（2）：305－308.

［15］ 王鳳玲，唐麗琴，楊峰，等.小檗堿對(duì)高脂合并STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎臟FN 與CTGF 表達(dá)的影響［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（4）：549－551.