馮洪濤，李紅普

(河南鄭州市人民醫(yī)院普外二科 450000)

論著·基礎(chǔ)研究

miRNA-29a對平滑肌細胞增殖凋亡的影響

馮洪濤，李紅普△

(河南鄭州市人民醫(yī)院普外二科 450000)

目的 檢測miRNA-29a在腹主動脈瘤患者與正常人血清中的表達差異，探討miRNA-29a過表達對人腹主動脈平滑肌細胞(HVSMCs)增殖凋亡的影響。方法收集該院2011年3月至2014年3月間確診腹主動脈瘤患者血清標(biāo)本25例，平均年齡(62.9±13.6)歲；同期收集與其年齡相匹配的正常老年人血清標(biāo)本25例，平均年齡(61.5±11.8)歲。用RT-PCR分別檢測其miRNA-29a表達。構(gòu)建人重組慢病毒載體MCS-CMV-miRNA；將構(gòu)建載體MCS-CMV-miRNA-29a轉(zhuǎn)染HVSMCs細胞，熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR及Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中miRNA-29a和miRNA-29a靶基因COL1A1的表達，最后應(yīng)用Annexin V/7-AAD雙染法檢測轉(zhuǎn)染后72 h對HVSMCs細胞凋亡的影響。結(jié)果在腹主動脈瘤患者中miRNA-29a表達較正常人低。構(gòu)建的重組慢病毒載體MCS-CMV-miRNA-29a轉(zhuǎn)染效率為(74.25±10.10)%，轉(zhuǎn)染后miRNA-29a及蛋白表達在靶細胞較對照組增多，MTS及Annexin V顯示miRNA-29a過表達后細胞增殖增多，凋亡減少。結(jié)論成功構(gòu)建攜帶miRNA-29a慢病毒載體，轉(zhuǎn)染后miRNA-29a穩(wěn)定表達，miRNA-29a過表達可促進細胞增殖，抑制其凋亡。

主動脈瘤，腹；miRNA-29a；慢病毒載體；肌細胞，平滑肌

腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是指由于腹主動脈壁的病變或損失，造成腹主動脈的局限性擴張、膨出，以搏動性腫塊為主要癥狀的疾病。通常將腹主動脈段動脈壁三層結(jié)構(gòu)持續(xù)性擴張至腎動脈處腹主動脈直徑1.5倍以上即定義為AAA，是一種常見的高病死率動脈退行性疾病[1-2]。目前，對于腹主動脈瘤具體發(fā)病機制尚不完全清楚，已有的報道顯示其發(fā)病與遺傳因素、炎癥、蛋白酶降解、平滑肌細胞凋亡等因素密切相關(guān)，其發(fā)病與其他腫瘤因化學(xué)輻射、基因突變等不同。人腹主動脈平滑肌細胞(HVSMCs)作為腹主動脈中膜的主要構(gòu)成成分，對維持動脈壁結(jié)構(gòu)和功能的完整性起到重要作用。近年來，一些報道顯示腹主動脈瘤組織中VSMC數(shù)量的減少是其形成過程中一個關(guān)鍵因素[3]。如何有效抑制VSMC的凋亡有望為延緩AAA的形成、發(fā)展提供新的治療思路。

微小RNA(micro RNA,miRNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA。研究表明miRNA參與各種生理、病理調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、造血過程、器官形成、細胞增殖凋亡，以及脂肪代謝等[4-5]。MiRNA-29a在各種實質(zhì)腫瘤細胞中表達增高，具有顯著的促增殖、抗凋亡的作用。同時，其在血管中層平滑肌細胞中表達豐度較高，通過促進新生內(nèi)膜形成幫助損傷血管修復(fù)[6]。且miRNA在惡劣的條件下仍保持穩(wěn)定，這使得通過檢測循環(huán)血中的miRNA作為疾病標(biāo)志物成為近年來的一個研究熱點。

MiRNA-29家族的成熟序列在人、大鼠、小鼠中幾乎是相同的。目前在人類中發(fā)現(xiàn)miRNA-29的靶基因數(shù)量最多，主要有COL1A1、COL1A2、MMP2等。其中，靶基因COL1A1與成骨不全及肝癌的形成有關(guān)。本研究旨在首先探討miRNA-29a在腹主動脈瘤患者和正常人血清中的表達差異；其次用慢病毒構(gòu)建miRNA-29a過表達模型，初步探究miRNA-29a對VSMC細胞增殖凋亡的影響，意在為今后臨床AAA的防治工作找到新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料 構(gòu)建慢病毒的主要載體系統(tǒng)由如下3個部分組成：Helper1.0載體，pHelper2.0載體及MCS-CMV載體(上海吉凱，中國);大腸埃希菌DH5α,293T細胞本室保存;人主動脈血管平滑肌細胞(美國ScienCell公司，No.6110)。

1.2 主要試劑 Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)；Plasmid抽提Kit(Qiagen公司，美國);淋巴細胞分離液(天津灝洋，中國)；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(GIBOCO公司，美國)；Taq polymerase、Primer、dNTP(TaKaRa公司，日本)；COL1A1小鼠抗人抗體、山羊抗小鼠二抗(Abcam公司，美國)；瓊脂糖(賽百盛公司，中國)；MTS(Promega公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 資料收集 收集2011年3月至2014年3月間本院門診及住院AAA患者血清25例，其中，男16例，女9例，年齡49～81歲，平均(62.9±13.6)歲；同期收集本院體檢中心正常老年人血清25例，其中，男15例，女10例，年齡55～85歲，平均(61.5±11.8)歲。

1.3.2 血清中miRNA-29a的RT-PCR檢測 用淋巴細胞分離液提取分離淋巴細胞，收集完全血清層，按照說明要求常規(guī)提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。每孔RT-PCR反應(yīng)體系為25 μL，所加試劑分別如下：SYBR Premix EX Taq Ⅱa(12.5 μL)，primer(10 μmol/L×1 μL)，DNA(50 ng/μL×2 μL),ddH2O(8.5 μL)，結(jié)果經(jīng)ABI PRISM 7500系統(tǒng)分析。miRNA-29a引物F：5′-ACC TGT CAC TGT CTT GTA CCC TTG T-3′，R：5′-CGG CGT TTG GAG TGG TAG AA-3′。RT-PCR反應(yīng)條件為97 ℃預(yù)變性5 min,97 ℃ 1 min變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s，共循環(huán)30次，后72 ℃延伸7 min,所得結(jié)果經(jīng)2-ΔΔCT計算得出目的RNA的相對含量(relative quantity,RQ)。

1.3.3 慢病毒MCS-CMV-miRNA-29a載體構(gòu)建及病毒包裝 miRNA-29a基因由PCR進行擴增，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min。將目的基因克隆到慢病毒MCS-CMV Vector中，所用引物上游序列為：5′-CAA AAC CCC CAC CAA GTC TAT GGA A-3′,下游序列：5′-TAA AGT ATA ACC ATT CAT GA-3′。LB培養(yǎng)液擴增轉(zhuǎn)化菌DH5α，Plasmid抽提盒提取MCS-CMV-miRNA-29a，包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0 DNA。根據(jù)Invitrogen公司Lipofectamine 2000說明書將構(gòu)建質(zhì)粒MCS-CMV-miRNA-29a及慢病毒包裝pHelper1.0、pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細胞，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光融合現(xiàn)象，收集含慢病毒顆粒的細胞上清液，-80 ℃保存，RT-PCR檢測病毒滴度。

1.3.4 細胞培養(yǎng) 將在干冰保存中的原代細胞懸液常規(guī)解凍、復(fù)蘇。以1×105細胞密度培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，置于細胞培養(yǎng)箱中，以37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，相差倒置顯微鏡下觀察，融合率在90%左右時胰酶消化法傳代培養(yǎng)，采用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3.5 慢病毒細胞轉(zhuǎn)染 以每孔4×104細胞數(shù)接種于6孔板中，按照說明以感染復(fù)數(shù)(MOI值)100進行轉(zhuǎn)染。分MCS-CMV-miRNA-29a(轉(zhuǎn)染組)，MCS-CMV-EGFP(陰性對照組)，以及不加病毒的空白對照組。轉(zhuǎn)染第4天后熒光顯微鏡下進行觀察，以評估轉(zhuǎn)染效率。

1.3.6 半定量RT-PCR 半定量RT-PCR與前述RT-PCR步驟相似，最后將cDNA在3%的瓊脂糖凝膠中行電泳，結(jié)果用Quantity one軟件分析。miRNA-29a引物F：5′-ACC TGT CAC TGT CTT GTA CCC TTG T-3′，R：5′-CGG CGT TTG GAG TGG TAG AA-3′。反應(yīng)條件如下：97 ℃預(yù)變性5 min,97 ℃ 1 min變性，56 ℃ 30 s退火，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)30次，后72 ℃延伸7min。

1.3.7 Western-blot檢測蛋白 每組細胞經(jīng)處理后常規(guī)提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組50 μg體系下行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。按1∶1 000比例稀釋的一抗，在4 ℃下孵育過夜。次日用TBST洗滌，15 min/次×3次，4 ℃孵育COL1A1抗體(1∶1 000稀釋)過夜，TBST緩沖液洗膜，37 ℃下山羊抗小鼠二抗孵育1 h，再用TBST洗膜。最后ECL顯影，bio-rad凝膠成像儀拍照分析。

1.3.8 MTS法檢測細胞增殖 取對數(shù)期細胞接種于96孔板中。每孔約6×103個細胞，實驗組分為miRNA-29a轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、空白對照組共3組，每組設(shè)立4個平行復(fù)孔。分別在24、48、72 h后加入MTS試劑20 μL/孔，37 ℃的5% CO2飽和濕度孵箱中靜置1 h，酶調(diào)儀在490 nm的波長下讀取OD值，各平行孔取平均值。實驗獨立重復(fù)3次。

1.3.9 Annexin V/7-AAD檢測細胞凋亡 各組處理后的細胞分別換用無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，以誘導(dǎo)凋亡。72 h后胰酶消化收集細胞，用PBS洗2遍，按照說明分析加入Binding Buffer(200 μL)、Annexin V-PE(10 μL)和7-AAD(5 μL)避光孵育15 min，最后加入300 μL ending Buffer，上機檢測細胞凋亡的變化。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測miRNA-29a的表達 經(jīng)RT-PCR檢測結(jié)果得出miRNA-29a表達在AAA中比正常人低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖1。

圖1 RT-PCR檢測AAA與正常人miRNA-29a的表達

2.2 miRNA-29a重組慢病毒載體在腹主動脈瘤細胞中的綠色熒光蛋白表達及轉(zhuǎn)染效率的檢測 將MCS-CMV-miRNA-29a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人腹主動脈瘤細胞，在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況(圖2)。取3個視野下平均轉(zhuǎn)染效率達(74.25±10.01)%，說明構(gòu)建的慢病毒載體高效轉(zhuǎn)染人腹主動脈瘤細胞。

2.3 RT-PCR結(jié)果顯示miRNA-29a表達增高 在慢病毒MCS-CMV-miRNA-29a載體轉(zhuǎn)染腹主動脈瘤細胞第4天后，miRNA-29a表達明顯高于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),如圖3。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后VSMC熒光檢測

1、3、5：β-actin；2：轉(zhuǎn)染組；4：陰性對照組；6：空白對照組。

圖3 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miRNA-29a的表達

2.4 Western-blot檢測miRNA-29a靶基因蛋白穩(wěn)定表達 轉(zhuǎn)染后miRNA-29a靶基因COL1A1蛋白表達量明顯較其他實驗組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

1：轉(zhuǎn)染組；2：陰性對照組；3：空白對照組。

圖4 Western-blot檢測MCS-CMV-miRNA-29a轉(zhuǎn)染AAA-SMC細胞后第4天miRNA-29a靶基因蛋白表達

2.5 miRNA-29a對人AAA-SMC細胞增殖的影響 各組細胞在處理24、48、72 h后，MTS檢測結(jié)果顯示不同時間點miRNA-29a轉(zhuǎn)染組的OD值明顯高于其他兩組，miRNA-29a轉(zhuǎn)染組與其他兩組間經(jīng)單因素方差分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明miRNA-29a過表達能夠有效促進VSMC的增殖。而陰性對照組及空白對照組間OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 MTS檢測各組HVSMCs增殖率的改變(OD值)

2.6 Annexin V/7-AAD檢測各組細胞凋亡情況 各組細胞無血清培養(yǎng)基饑餓刺激72 h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率顯示miRNA-29a轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率較其他兩組明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而陰性對照組及空白對照組間細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 Annexin V/7-AAD檢測各組細胞凋亡的影響(%)

3 討 論

多數(shù)AAA是無癥狀的，早期的發(fā)現(xiàn)經(jīng)常伴有一些偶然因素，如其他原因行腹部B超、CT或磁共振成像(MRI)檢查時被發(fā)現(xiàn)。但AAA一旦發(fā)生破裂導(dǎo)致破裂性腹主動脈瘤(rupture abdominal aortic aneurysm，rAAA)則是臨床上病死率最高的并發(fā)癥之一，通常因為發(fā)病迅猛，不能及時得到救治。流行病學(xué)調(diào)查顯示，大約4%～5%美國人的猝死源于rAAA[7]。由此可見，AAA的早期篩查和預(yù)防其進一步發(fā)展在臨床實踐中有著重要作用。

miRNA是一類單鏈小分子RNA，通過與靶基因的3′-UTR端結(jié)合配對，在轉(zhuǎn)錄水平對靶基因進行表達調(diào)控，從而參與了細胞的增殖、突變及細胞凋亡等生理病理過程[8]。Redova等[9]首先報道證實了人體外周血中存在大量miRNA，且其以一種非常穩(wěn)定的形式存在于人體循環(huán)血中。因此，將血清中miRNA作為疾病標(biāo)志物的研究成為近年來的熱點。Jones等[10]研究發(fā)現(xiàn)胸主動脈瘤組織中包括miRNA-29a在內(nèi)的miRNAs的表達水平降低，且與主動脈瘤的直徑呈負相關(guān)。本研究通過對比AAA患者及正常人群血清中miRNA-29a的表達差異發(fā)現(xiàn)，前者miRNA-29a的表達顯著低于正常組(P<0.05)。這一發(fā)現(xiàn)為miRNA-29a成為AAA的血清標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)，同時也為研究其在AAA發(fā)病過程中發(fā)揮的作用提供了可能。

主動脈平滑肌細胞(VSMCs)是腹主動脈中層的主要細胞，直接或間接地分泌彈力蛋白、膠原蛋白及其他基質(zhì)蛋白主動脈壁最重要的結(jié)構(gòu)成分，對動脈彈力板層的構(gòu)建和修復(fù)起重要作用。Rowe等[11]比較了正常、粥樣硬化和AAA主動脈中VSMCs的凋亡情況，結(jié)果顯示在AAA組織中細胞凋亡的數(shù)量是其他兩組的3倍以上，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，VSMCs增殖抑制、凋亡增加是AAA發(fā)生、發(fā)展的一個重要原因。因此，本研究以HVSMCs為研究對象，意在探討miRNA-29a對于其體外培養(yǎng)環(huán)境中增殖、凋亡的影響。

慢病毒作為一種基因調(diào)控的載體，能高效、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染細胞，且其本身的轉(zhuǎn)染對細胞生物學(xué)行為影響較小，這種方法已被廣泛用于科研中[12]。本研究結(jié)果顯示，慢病毒為載體的轉(zhuǎn)染效率(74.25±10.10)%，功能學(xué)檢測顯示，miRNA-29a的mRNA及其靶基因蛋白COL1A1表達均在轉(zhuǎn)染組顯著升高，證實慢病毒對VSMCs有著較高的轉(zhuǎn)染效率。

細胞的正常增殖、凋亡平衡對維持器官內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有著至關(guān)重要的作用，其細胞的惡性增殖或凋亡受到抑制被認為是腫瘤發(fā)生的重要機制，因此，調(diào)控細胞增殖及凋亡成為研究腫瘤發(fā)病機制及治療的有效方法。在骨肉瘤和腎纖維化的研究中，miRNA-29a對平滑肌細胞的增殖、凋亡有著明顯的調(diào)控作用[13-14]，但其對HVSMCs增殖、凋亡影響還未見報道。通過MTS結(jié)果顯示miRNA-29a過表達的HVSMCs在不同時間點的OD值均明顯高于其他兩組(P<0.05)，而空病毒轉(zhuǎn)染組與空白對照組間的OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果說明病毒本身的轉(zhuǎn)染并不影響細胞的增殖，而miRNA-29a能夠有效促進HVSMCs細胞的增殖。另一方面，流式細胞檢測結(jié)果顯示miRNA-29a過表達能夠有效地保護無血清培養(yǎng)所誘導(dǎo)的細胞凋亡，與其他兩組比較，miRNA-29a轉(zhuǎn)染組細胞的凋亡率顯著下降(P<0.05)。

綜上所述，本研究顯示在AAA患者血清中miRNA-29a的表達較正常人顯著降低，miRNA-29a低表達與AAA的發(fā)生有著密切關(guān)系。所構(gòu)建的miRNA-29a過表達慢病毒載體能有效提高HVMSCs中miRNA-29a的表達水平，通過對非編碼RNA及其靶基因的增加血管平滑肌細胞的增殖，同時抑制其凋亡，為研究AAA的發(fā)病機制及治療方法開拓了新思路及新方法。

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The effect of miRNA-29a on the proliferation and apoptosis of HVSMCs cells

FengHongtao，LiHongpu△

(TheSecondDepartmentofGeneralSurgery,ZhengzhouPeople′sHospital,Zhengzhou，Henan450000，China)

Objective To detect the expression of miRNA-29a in abdominal aortic aneurysm(AAA) patients and construct a recombinant lentiviral vector carrying miRNA-29a,transfection of human abdominal aortic vascular smooth muscle cells(HVSMCs),and to investigate the alteration on the proliferation in HVSMCs.MethodsCollected 25 AAA patients′ serum and 25 normal elderly serum specimens from March 2011 to March 2014,the mean age were 62.9±13.6 and 61.5±11.8 separately.Employ RT-PCR analysis the miRNA-29 expression in different group.The MCS-CMV-miRNA-29a was transfected into HVSMCs cells,the transfection efficiency was observed with fluorescence microscope,the mRNA and COL1A1 protein expresstion was detected by RT-PCR and Western blot respectively.MTS method was used to determine effects of cell inhibition rates of different groups,cell apoptosis was analysised by Annexin V/7-AAD double staining after 72 h.ResultsThe expression of miRNA-29a with AAA was lower than normal group.The transfection efficiency was (74.25±10.10)%.miRNA-29a mRNA and its target protein COL1A1 expression increased significantly compared with the control group after transfection,MTS and Annexin V/7-AAD results showed that cell apoptosis was decreased after miRNA-29a overexpression,cell proliferation was increased compared with the control group.ConclusionThe miRNA-29 expression decreased associated with the occurrence of abdominal aortic aneurysm,but overexpress miRNA-29a in HVSMC cells by lentivirus mediated,which could promote the proliferation of cells,inhibit its apoptosis.

aortic aneurysm,abdominal；miRNA-29a；lentiviral vector;mgocgtes,smooth muscle

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.009

馮洪濤(1973-)，醫(yī)師，碩士,主要從事周圍血管外科研究。△

,Tel：13937122886；E-mail：lihongpu371@126.com。

R654.4

A

1671-8348(2015)35-4925-04

2015-05-26

2015-07-16)