馬 莎,林 俊,晉 松,李 芹,張 虹,王 靜

(云南省第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,昆明 650032)

論著·基礎(chǔ)研究

shRNA抑制survivin基因表達(dá)對(duì)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

馬 莎,林 俊△,晉 松,李 芹,張 虹,王 靜

(云南省第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,昆明 650032)

目的 研究靶向存活素(survivin)的短發(fā)夾RNA真核表達(dá)質(zhì)粒(shRNA)對(duì)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法合成靶向survivin的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至經(jīng)VEGF(50 ng/mL)處理的HUVEC細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48 h后，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和蛋白印跡法檢測(cè)HUVEC中survivin的mRNA表達(dá)及蛋白水平。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果(1)survivin-shRNA質(zhì)粒試驗(yàn)組與陰性對(duì)照shRNA質(zhì)粒組及空白對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染48 h后人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞survivin的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。(2)與陰性對(duì)照shRNA組及空白對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染后的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力明顯下降。轉(zhuǎn)染后24、48、72 h生長(zhǎng)抑制率分別為(13.53±3.91)%、(38.97±1.82)%、(65.75±1.83)%，于轉(zhuǎn)染后72 h最為顯著。(3)試驗(yàn)組凋亡率為(28.07±1.71)%，較陰性對(duì)照組(11.45±1.52)%和空白對(duì)照組(10.04±1.46)%顯著增高(P<0.05)。結(jié)論靶向survivin的shRNA質(zhì)粒能通過(guò)下調(diào)survivin表達(dá)，進(jìn)而抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；存活素；shRNA；增殖；細(xì)胞凋亡

存活素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis of protein,IAP)家族成員，是具有強(qiáng)大抗凋亡效應(yīng)的蛋白[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEFG)可誘導(dǎo)survivin抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)血管生成[2]。深入認(rèn)識(shí)和揭示survivin在介導(dǎo)VEGF促血管新生中的作用對(duì)尋找類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)的基因靶向治療的方法具有重要意義。本試驗(yàn)旨在通過(guò)轉(zhuǎn)染survivin-短發(fā)夾RNA真核表達(dá)質(zhì)料(shRNA)至人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)，觀察抑制survivin對(duì)外源性VEGF處理后HUVEC增殖及凋亡的影響，為RA基因靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(凱基生物公司)，VEGF165(美國(guó)Peprotech公司)，澳洲胎牛血清FBS、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、DMSO(Sigma公司)，survivin兔抗人單克隆抗體(Abcam公司)，GAPDH鼠抗人單克隆抗體(上海Abmart公司)，SYBR Green Master(Roch公司)、Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，shRNA-survivin表達(dá)質(zhì)粒載體及陰性對(duì)照質(zhì)粒載體(吉?jiǎng)P基因技術(shù)公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(Invitrogen公司)，蛋白濃度測(cè)定試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯色法試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 外源性VEGF處理HUVEC HUVEC細(xì)胞系采用含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基加雙抗，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。細(xì)胞生長(zhǎng)密度至85%～90%，按1∶2比例進(jìn)行傳代。轉(zhuǎn)染前24 h選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs細(xì)胞，按照6×105/孔接種至6孔板，每孔使用2 mL不含抗菌藥物的完全培養(yǎng)基，加入VEGF使其終濃度為50 ng/mL[3]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 shRNA載體轉(zhuǎn)染HUVEC 經(jīng)VEGF處理細(xì)胞24 h后將VEGF培養(yǎng)基棄去，PBS潤(rùn)洗3次，每孔加入2 mL不含抗菌藥物完全培養(yǎng)基，設(shè)空白對(duì)照組(加入RPMI-1640培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照組(加入negative-shRNA)、試驗(yàn)組(加入survivin-shRNA)，靶序列為5′-AGA ATT AAC CCT TGG TGA A-3′，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，呈GPF綠色熒光的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)4個(gè)高倍視野，轉(zhuǎn)染效率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總的細(xì)胞數(shù)×100%，根據(jù)轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HUVEC中survivin mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。以cDNA作為模板，采用SYBR熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組mRNA表達(dá)，反應(yīng)體系為25 μL,每個(gè)樣品分別設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)。survivin上游引物：5′-GAC CAC CGC ATC TCT ACA TTC-3′，下游引物5′-TGC TTT TTA TGT TCC TCT ATG GG-3′；GAPDH的上游引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物：5′-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3′；實(shí)時(shí)定量PCR儀循環(huán)設(shè)置：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用相對(duì)定量方法2-△△Ct值表示目的基因的mRNA水平[4]。

1.2.4 Western印跡法檢測(cè)survivin蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并提取蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。用15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，孵育survivin一抗(1∶2 000稀釋)和內(nèi)參GAPDH一抗(1∶10 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜，用特異性辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶7 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗膜，顯色并于暗室曝光。Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描，用Scion-Image軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)目的蛋白和內(nèi)參GAPDH蛋白的電泳條灰度值，以二者比值代表目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 MTT法檢測(cè)抑制survivin表達(dá)對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24 h按5×103個(gè)/孔細(xì)胞接種至96孔板，其后按上述分組及96孔板說(shuō)明參數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT 30 μL，37 ℃作用4 h，PBS洗滌2次，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光振蕩15 min使結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-試驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值)×100%。

1.2.6 細(xì)胞凋亡分析 采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。接種細(xì)胞至爬片后按上述方法轉(zhuǎn)染及分組，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞爬片，按說(shuō)明書進(jìn)行操作，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每張爬片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野(×400)中的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)和總的細(xì)胞核數(shù)，凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)/總的細(xì)胞核數(shù)計(jì)算細(xì)胞×100%，取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1 觀察轉(zhuǎn)染48 h后GFP綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞陽(yáng)性率 觀察轉(zhuǎn)染48 h后HUVECs中GFP綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞陽(yáng)性率，通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中質(zhì)粒濃度為1.5 μg/mL時(shí)可獲得最佳的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70%以上，見圖1。

A、B：試驗(yàn)組；C、D：陰性對(duì)照組。

圖1 轉(zhuǎn)染48 h后試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組細(xì)胞(倒置相差顯微鏡，×200)

表1 轉(zhuǎn)染48 h后各組檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)survivin mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量見表1，試驗(yàn)組顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01);陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 Western blot檢測(cè)survivin蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、試驗(yàn)組survivin蛋白表達(dá)情況見圖2，相對(duì)表達(dá)量見表1。試驗(yàn)組survivin蛋白表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，表達(dá)抑制率為56.7%;陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性結(jié)果 轉(zhuǎn)染24、48、72 h后各組A值見表2，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均有不同程度減慢(P<0.01)，生長(zhǎng)抑制率分別為(13.53±3.91)%、(38.97±1.82)%、(65.75±1.83)%，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 各組HUVEC細(xì)胞survivin的蛋白表達(dá)量

表2 各組HUVEC細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染時(shí)間MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的A值比較

2.5 survivin-shRNA干擾HUVEC細(xì)胞后對(duì)其凋亡的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，試驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為(28.07±1.71)%，與空白對(duì)照組(10.04±1.46)%和陰性對(duì)照組(11.45±1.52)%比較，試驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯增加(F=164.32，P<0.01)。而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

血管翳是RA病變過(guò)程中一個(gè)特征性的病理表現(xiàn)，新生血管形成在RA的侵蝕和破壞過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用并貫穿整個(gè)病程[5]。VEGF被認(rèn)為是血管新生過(guò)程中的核心因子，其通過(guò)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)新生血管形成，并增加血管通透性及炎性物質(zhì)滲出，促進(jìn)炎癥形成與發(fā)展[6]。VEGF及其受體在RA動(dòng)物模型及RA患者的滑膜組織及血清中均高表達(dá)[7]。體外試驗(yàn)也證明了關(guān)節(jié)炎的滑膜細(xì)胞能夠分泌較高水平的VEGF[8]。RA血清VEGF水平與疾病嚴(yán)重程度及并發(fā)癥的出現(xiàn)存在相關(guān)性[9]，同時(shí)抑制血管生成的藥物可有效緩解RA的病情[10]，腺病毒介導(dǎo)的反義VEGF基因轉(zhuǎn)染可有效減輕膠原關(guān)節(jié)炎癥狀，減輕滑膜血管翳對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞和病理改變[11]。然而，VEGF作為具有重要生理功能的細(xì)胞因子，抑制其表達(dá)也將帶來(lái)新的健康問(wèn)題[12]。

survivin是IAP家族具有強(qiáng)大凋亡抑制效應(yīng)的蛋白，survivin可以與VEGF相互作用，在VEGF誘導(dǎo)下，內(nèi)皮細(xì)胞中survivin表達(dá)增強(qiáng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)血管生成[13]。survivin表達(dá)異常增高則促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和三維毛細(xì)血管網(wǎng)的形成[12]。采用反義技術(shù)使內(nèi)皮細(xì)胞survivin表達(dá)缺失，可抑制VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和血管的退行性變，進(jìn)而阻抑血管新生[3]。研究表明survivin在常見惡性腫瘤中表達(dá)，而在正常成熟的細(xì)胞和組織中無(wú)表達(dá)，這些研究使得通過(guò)抑制survivin表達(dá)來(lái)調(diào)控血管新生過(guò)程在治療RA成為可能。

本試驗(yàn)通過(guò)VEGF處理HUVEC促進(jìn)細(xì)胞增殖及上調(diào)survivin表達(dá)而模擬體外類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中血管新生狀態(tài)，構(gòu)建靶向survivin的shRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染經(jīng)外源性重組VEGF165處理的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后HUVEC中survivin的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降，試驗(yàn)組mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(27.67±3.51)%，蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.74±0.05，表達(dá)抑制率為56.7%，顯著低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明在一定程度上survivin-shRNA實(shí)現(xiàn)了對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞survivin基因的沉默，而陰性對(duì)照組shRNA對(duì)survivin的表達(dá)無(wú)影響。MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖效應(yīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后試驗(yàn)組細(xì)胞增殖的抑制于轉(zhuǎn)染48 h后出現(xiàn)，隨著時(shí)間的增加抑制效應(yīng)遞增，72 h抑制達(dá)到高峰，生長(zhǎng)抑制率為(65.75±1.83)%，實(shí)現(xiàn)了對(duì)HUVEC增殖的下調(diào)。轉(zhuǎn)染48 h后試驗(yàn)組凋亡率為(28.07±1.71)%，較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，證明下調(diào)survivin基因的表達(dá)可促進(jìn)HUVEC細(xì)胞凋亡。

綜上所述，通過(guò)抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中survivin的表達(dá)可減少外源性VEGF促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，推測(cè)survivin參與介導(dǎo)VEGF促血管生成過(guò)程，與Mesri等[3]的研究結(jié)果一致。提示在RA中抑制survivin基因的表達(dá)將在抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜血管翳形成方面發(fā)揮作用，對(duì)RA有潛在的治療價(jià)值。下一步將借助survivin-shRNA載體上攜帶的抗性標(biāo)記篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性HUVEC細(xì)胞，研究其在更長(zhǎng)時(shí)間范圍的細(xì)胞生長(zhǎng)特性及炎性因子分泌情況，為RA基因靶向治療奠定基礎(chǔ)。

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Effects of shRNA-mediated survivin silencing on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells*

MaSha，LinJun△，JinSong，LiQin，ZhangHong，WangJing

(DepartmentofRheumatoidandImmunology,theFirstPeople′sHospitalofYunnanProvince，Kunming,Yunnan650032，China)

Objective To investigate the effect of short hairpin RNA(shRNA) eukaryotic expression vector-mediated silencing of the survivin-gene on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).MethodsThe shRNA vector targeting the survivin gene and negative control vector were transfected into human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) incubated with 50 ng/mL of recombinant VEGF in vitro by lipofectamine 2000.Transfection after 48 h,the expression of survivin mRNA and protein was detected by quantitative real-time PCR and Western blot,respectively.HUVEC proliferation was assayed by four methylthiazolyl tetrazolium(MTT) and cell apoptosis was detected by TUNEL.Results(1)Transfection with survivin-shRNA vector significantly down-regulated the expression of survivin mRNA and protein as compared with the control group,after transfection of 48 h(P<0.05).(2)After survivin-shRNA vector transfected,the proliferation of HUVEC decreased significantly.After transfection 24,48,72 h,the growth inhibition rate were (13.53±3.91)%,(38.97±1.82)%,(65.75±1.83)% respectively,at 72 hours after transfection was the most significant.(3)The apoptosis rate of experimental group was (28.07±1.71)%,which was higher than the negative control group (11.45±1.52)% and blank control group (10.04±1.46)% (P<0.05).ConclusionThe shRNA-mediated mediated silencing of the survivin-gene could significantly inhibit proliferation and promote the apoptosis of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts by regulating survivin expression．

vascular endothelial growth factor;survivin;short hairpin RNA;proliferation;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.008

云南省科技廳昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2011FB215)。

：馬莎(1982-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究?！?/p>

，Tel：13888906672；E-mail：linjun06@sina.com。

R593.22

A

1671-8348(2015)35-4922-03

2015-05-15

2015-07-22)