霍雅婷，程遠雄△，賴文巖，蔡開燦

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院:1.呼吸科；2.心血管內(nèi)科；3.心胸外科，廣州 510515)

·論 著·

Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路在誘導氣道平滑肌細胞外基質(zhì)蛋白沉積中的作用*

霍雅婷1，程遠雄1△，賴文巖2，蔡開燦3

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院:1.呼吸科；2.心血管內(nèi)科；3.心胸外科，廣州 510515)

目的 探討Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路在TGF-β1誘導人氣道平滑肌細胞(HASMC)細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白沉積中的作用。方法將原代培養(yǎng)的HASMC用于實驗。用Western blot的方法來分析蛋白表達量，用實時熒光定量PCR的方法來分析ECM蛋白的基因表達。結(jié)果用TGF-β1刺激體外培養(yǎng)的HASMC,可以引起膠原蛋白Ⅰα1(P<0.01)及ECM蛋白mRNA(包括膠原蛋白Ⅰα1、纖連蛋白、多功能蛋白聚糖、層粘連蛋白α2及核心蛋白多糖)表達增加(P<0.01)。TGF-β1可以引起β-連環(huán)蛋白(P<0.05)及其mRNA表達顯著增加(P<0.01)。TGF-β1通過抑制糖原合酶激酶3(GSK3)β活化(P<0.01)而引起非磷酸化的β-連環(huán)蛋白表達增加(P<0.01)。此外，用Wnt信號通路藥理學抑制劑PKF115-584可以明顯抑制TGF-β1誘導的膠原蛋白Ⅰα1(P<0.01)及ECM蛋白(包括膠原蛋白Ⅰα1、纖連蛋白及多功能蛋白聚糖)的基因表達(P<0.01)。結(jié)論HASMC中Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的活化，參與了TGF-β1誘導的ECM蛋白沉積。

肌細胞，平滑肌；細胞外基質(zhì)；轉(zhuǎn)化生長因子β1；β-連環(huán)蛋白

氣道重塑是支氣管哮喘的病理特征之一，是導致哮喘氣道高反應性和氣流受限的關(guān)鍵因素，徹底控制或延緩氣道重塑，對哮喘尤其是難治性哮喘的治療及改善預后有重要意義[1]。有文獻報道氣道平滑肌細胞(ASMC)可通過細胞增殖、釋放多種炎癥介質(zhì)、生長因子及細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白參與氣道重塑[2]。而Thomson等[3]認為，由ASMC分泌的ECM蛋白占氣道重塑組分的50%之多，是氣道重塑的關(guān)鍵因素。因此，研究氣道平滑肌細胞分泌ECM蛋白的機制，對控制氣道重塑具有十分重要的意義。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)可以刺激肺臟中的結(jié)構(gòu)細胞和炎性細胞產(chǎn)生ECM，參與氣道重塑[4]。β-連環(huán)蛋白是Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路中的核心蛋白，它參與調(diào)節(jié)成纖維細胞中纖連蛋白[5]及血管平滑肌細胞中多功能蛋白聚糖等ECM蛋白的基因轉(zhuǎn)錄。然而，β-連環(huán)蛋白在ASMC分泌ECM蛋白中的作用研究尚少。因此，本文探討β-連環(huán)蛋白在氣道平滑肌細胞分泌ECM蛋白中的作用，為治療氣道重塑尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 優(yōu)級胎牛血清(Gibco公司)、DMEM(Hyclone公司)、胰蛋白酶(Hyclone公司)；TGF-β1(Prospec公司)、PKF115-184(Tocris公司)；BCA100蛋白定量分析試劑盒和全蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；總RNA提取試劑(Trizol公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)SYBR?Premix Ex TaqTM、PrimeScript?RTreagentKit(TOYOBO公司)；小鼠抗平滑肌肌動蛋白(α-SMA，上海碧云天生物技術(shù)研究所)、小鼠抗β-actin(北京中杉金橋生物科技有限公司)、小鼠抗GAPDH抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、兔抗β-連環(huán)蛋白抗體(Millipore公司)、小鼠抗非磷酸化β-連環(huán)蛋白抗體(Millipore公司)，兔抗糖原合酶激酶3(GSK3)α+β抗體(Abcam公司)、兔抗磷酸化GSK3β抗體(Abcam公司)、兔抗膠原蛋白Ⅰα1抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、山羊抗兔、小鼠IgG-HRP二抗(杭州弗德生物技術(shù)有限公司)、FITC-山羊抗小鼠(北京中杉金橋生物科技有限公司)；DAPI(廣州威佳科技有限公司)；ECL化學發(fā)光染色液(杭州弗德生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代HASMC的培養(yǎng)與鑒定 采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)HASMC。經(jīng)患者家屬同意，取南方醫(yī)院胸外科肺葉切除術(shù)手術(shù)標本，無菌條件下分離葉、段支氣管中膜平滑肌層，剪成約1 mm3大小貼于培養(yǎng)瓶底，加入含20%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。待細胞從組織塊周圍爬出并生長融合，傳代，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，取第2～6代對數(shù)生長期細胞用于實驗研究。用細胞免疫熒光α-SMA特異性染色對細胞進行鑒定。

1.2.2 qRT-PCR檢測mRNA表達量 細胞培養(yǎng)結(jié)束后，采取Trizol一步法提取細胞總RNA，再經(jīng)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，實時熒光定量檢測基因相對表達量。各基因的基因庫編號及上下游引物序列如下：

β-連環(huán)蛋白(NM_001904)：5′-CCC ACT AAT GTC CAG CGT TT-3′，5′-AAT CCA CTG GTG AAC CAA GC-3′；

膠原蛋白Ⅰ(NM_000088)：5′-AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT-3′，5′-TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG-3′；

纖連蛋白(NM_212482)：5′-TCG AGG AGG AAA TTC CAA TG-3′，5′-ACA CAC GTG CAC CTC ATC AT-3′；

層粘連蛋白α2(NM_000426)：5′-GCC TTC TTC TCG GTG ACT TG-3′，5′-CCC TCT GCC AGC TGA ATA AG-3′；

多功能蛋白聚糖(NM_004385)：5′-GGG AAC CTG GTG AAG AAA CA-3′，5′-CTT CCA CAG TGG GTG GTC TT-3′；

核心蛋白多糖(NM_001920)：5′-AAT TGA AAA TGG GGC TTT CC-3′，5′-GCC ATT GTC AAC AGC AGA GA-3′；

GAPDH(NM_002046)：5′-GCA CCG TCA AGG CTG AGA A-3′，5′-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3′。

逆轉(zhuǎn)錄反應條件為：37 ℃變性15 min，98 ℃退火5 min，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。于羅氏480定量PCR儀行標準兩步法PCR反應，第一階段：95 ℃預變性30 s；第二階段：95 ℃變性5 s，60 ℃退火及延伸30 s；重復40個循環(huán)，冷卻40 ℃，30 s。反應結(jié)束后觀察融解曲線、擴增曲線，以2-△△CT值表示各組目的基因相對表達水平。

1.2.3 Western blot檢測蛋白水平變化 細胞培養(yǎng)結(jié)束后，按全蛋白提取試劑盒說明書程序操作：細胞經(jīng)預冷的PBS液洗2次，快速加入蛋白裂解液，冰上充分裂解后，收集細胞，轉(zhuǎn)移至EP管，4 ℃ 12 000 g離心20 min。吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度。與5×loading buffer按4∶1體積比混勻，煮沸變性7 min。取20 μg總蛋白以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)至PVDF膜，室溫下5% BSA封閉2 h后，分別加入兔抗β-連環(huán)蛋白(1∶5 000稀釋)、GSK3(α+β)(1∶1 000稀釋)，磷酸化GSK3β(1∶500稀釋)、膠原蛋白Ⅰα1(1∶500稀釋)，小鼠抗非磷酸化β-連環(huán)蛋白(1∶1 000稀釋)、β-actin(1∶1 000稀釋)、GAPDH(1∶1 000稀釋)一抗，4 ℃孵育過夜。漂洗3次后加入山羊抗兔、鼠IgG-HRP二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，漂洗3次后，ECL化學發(fā)光法顯示結(jié)果。用ImageJ2x圖像分析軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin或GAPDH條帶灰度值之比表示相應蛋白表達水平；p-GSK3β與GSK3(α+β)條帶灰度值之比表示GSK3β磷酸化水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行分析處理，多組比較采用單向方差分析，先進行方差齊性檢驗，方差齊，選用LSD即最小差異法；若方差不齊，采用校正的F檢驗(Welch法)，并選用DunnettT3做多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代HASMC培養(yǎng)與鑒定 光學顯微鏡下，HASMC呈長梭形，卵圓形胞核位于中央，生長融合后呈典型峰谷征；α-SMA免疫熒光染色陽性，鑒定為平滑肌細胞，見圖1。

A：普通光可見“峰谷征”；B：免疫熒光染色可見α-SMA為熒光。

圖1 原代培養(yǎng)的HASMC形態(tài)及表型鑒定(×100)

2.2 TGF-β1引起β-連環(huán)蛋白表達上調(diào) 用遞增濃度的TGF-β1(0.1～10.0 ng/mL)刺激HASMC 24 h，不同濃度的TGF-β1均能引起β-連環(huán)蛋白表達增加,對照組、0.1 ng/mL組、1.0 ng/mL組、10.0 ng/mL組的蛋白相對表達量分別為0.287 7±0.035 0、0.455 8±0.250 3、0.444 4±0.288 0、0.471 6±0.423 5，且與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；選取2.0 ng/mL作為刺激濃度，TGF-β1組β-連環(huán)蛋白表達量較對照組顯著增加(P<0.05)；TGF-β1也可引起β-連環(huán)蛋白mRNA表達增加(P<0.001)。

2.3 TGF-β1引起GSK3β磷酸化 用TGF-β1(2.0 ng/mL)刺激細胞不同時間(0～2 h)，P-GSK3β蛋白表達量在15～60 min范圍內(nèi)明顯增加(P<0.01)，說明TGF-β1在早期即可引起GSK3β磷酸化，見圖2。

**：P<0.01，與0 min比較。

圖2 不同時間GSK-3β蛋白磷酸化水平的改變

2.4 TGF-β1導致非磷酸化β-連環(huán)蛋白表達增加 用TGF-β1(2.0 ng/mL)刺激細胞不同時間(0～24 h)，非磷酸化β-連環(huán)蛋白表達量在2～16 h范圍內(nèi)增加，且在16 h時達到最大(P<0.01)，說明TGF-β1可以引起非磷酸化(活化的)β-連環(huán)蛋白表達增加，見圖3。

2.5 β-連環(huán)蛋白信號通路在TGF-β1誘導ECM基因表達中的作用 用TGF-β1(2 ng/mL)刺激細胞24 h,層粘連蛋白α2、多功能蛋白聚糖mRNA表達增加(P<0.01)，膠原蛋白Ⅰα1、纖連蛋白mRNA表達增加(P<0.01)，而核心蛋白多糖mRNA表達減少(P<0.01)，見圖4A。用藥理學抑制劑PKF115-584(100 nM)干預后，有效抑制了膠原蛋白Ⅰα1、纖連蛋白、多功能蛋白聚糖mRNA的表達(P<0.01)，見圖4B。

2.6 β-連環(huán)蛋白信號通路在膠原蛋白表達中的作用 用TGF-β1(2 ng/mL)刺激HASMC，膠原蛋白Ⅰα1表達量增加(P<0.01)，再用藥理學抑制劑PKF115-584(100 nM)干預細胞，膠原蛋白Ⅰα1表達量明顯減少(P<0.01)，見圖5。

***：P<0.01，與0 h比較。

圖3 非磷酸化β-連環(huán)蛋白表達水平

**：P<0.01，與對照組比較；※※※：P<0.01，(TGF-β1+PKF115-584)組與TGF-β1組比較。

圖4 β-連環(huán)蛋白信號通路在ECM基因表達中的作用

***：P<0.01，與對照組比較；###：P<0.01，(TGF-β1+PKF115-584)組與TGF-β1組比較。

圖5 PKF115-584對TGF-β1引起的膠原蛋白Ⅰα1表達的抑制作用

3 討 論

TGF-β是一種多功能細胞因子，在哮喘患者氣道中表達上調(diào)，并能刺激肺臟中多種結(jié)構(gòu)細胞和炎性細胞產(chǎn)生大量ECM蛋白[6]。ECM是一種具有復雜結(jié)構(gòu)的大分子物質(zhì)，發(fā)揮機械支撐作用，以維持氣道的正常功能。但在哮喘患者氣道平滑肌層中ECM蛋白表達異常增多[7]，增多的膠原蛋白Ⅰα1和纖連蛋白可以促進ASMC增殖、遷移[6]，促使氣道重塑的發(fā)生、發(fā)展。

β-連環(huán)蛋白是Armadillo蛋白家族中的一員，與細胞粘合連接處的鈣粘蛋白/連環(huán)蛋白復合物相關(guān)，發(fā)揮穩(wěn)定細胞-細胞接觸的作用[8]。同時，β-連環(huán)蛋白在經(jīng)典的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路中調(diào)節(jié)T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)介導的基因轉(zhuǎn)錄[9]。既往對Wnt通路的研究主要集中在腫瘤的發(fā)生上，近年來有研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路還與某些增生性疾病有關(guān)，如特發(fā)性肺纖維化等[10]。目前還認為β-連環(huán)蛋白可能在哮喘氣道重塑過程中起重要作用[11]。有文獻報道β-連環(huán)蛋白通過穩(wěn)定細胞間的接觸而調(diào)節(jié)ASMC的主動張力[12]，還可以促進ASMC增殖[13]，但在分泌ECM蛋白中的作用尚缺乏詳細研究。

本研究發(fā)現(xiàn)2.0 ng/mL為TGF-β1的有效刺激濃度，用此濃度的TGF-β1刺激HASMC，可引起β-連環(huán)蛋白在細胞質(zhì)中表達上調(diào)，且β-連環(huán)蛋白mRNA表達增加，說明β-連環(huán)蛋白的再合成也受到TGF-β1的調(diào)控。同樣濃度的TGF-β1也可誘導多種ECM蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄增強(層粘連蛋白α2、多功能蛋白聚糖、膠原蛋白Ⅰα1、纖連蛋白等)，其中以膠原蛋白Ⅰα1 mRNA表達增加最為明顯，故在后續(xù)實驗中，可將膠原蛋白Ⅰα1作為ECM蛋白的代表。有文獻認為細胞質(zhì)中β-連環(huán)蛋白水平是由GSK3嚴格調(diào)控的[14]。在本實驗中，TGF-β1引起GSK3β持續(xù)而強烈的磷酸化，繼而活化的(非磷酸化)β-連環(huán)蛋白表達增加，與文獻報道相符。Wnt信號通路藥理學抑制劑PKF115-584主要破壞細胞核中活化的β-連環(huán)蛋白與TCF-4之間的相互作用,進而抑制包括ECM蛋白在內(nèi)的靶基因轉(zhuǎn)錄[15]。本研究用100 nM濃度的PKF115-584對細胞進行干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠原蛋白Ⅰα1、纖連蛋白、多功能蛋白聚糖mRNA及膠原蛋白Ⅰα1蛋白表達均受到抑制，表明阻止β-連環(huán)蛋白與細胞核中轉(zhuǎn)錄因子的相互作用可以有效抑制ECM蛋白的表達增加。

綜上所述，經(jīng)典的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路是TGF-β1誘導HASMC分泌ECM蛋白中的關(guān)鍵途徑，阻斷該通路可顯著減少ECM表達。

目前，吸入糖皮質(zhì)激素是治療哮喘的主要方法，但這只能控制哮喘癥狀，卻不能充分抑制ECM蛋白表達導致的氣道重塑。因此，抑制β-連環(huán)蛋白的活化及其與細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF復合物的結(jié)合，可能成為治療哮喘氣道重塑的新靶點。

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Effect of β-Catenin signaling pathway on extra cellular matrix deposition by using airway smooth muscle cells induction*

HuoYating1，ChengYuanxiong1△，LaiWenyan2，CaiKaican3

(1.DepartmentofRespiratory；2.DepartmentofCardiology；3.DepartmentofThoracicCardiovascularSurgery，NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective To investigate the effect of Wnt/β-Catenin signaling pathway on EMC(extra cellular matrix) deposition by HASMC(human airway smooth muscle cells) in response to TGF-β1.MethodsThe primary cultured human bronchial smooth muscle cells were applied in this experiment.Protein expression was analyzed by Western blot and gene expression of ECM was evaluated by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsHASMC,cultured in vitro,by the stimulation of TGF-β1,can increase the expression of collagen I α1(P<0.01) and ECM protein mRNA(including collagen Iα1,fibronectin,versican,laminnα2 and decorin) (P<0.01).Meanwhile,TGF-β1 can cause an increase of nonphosphorylated β-Catenin protein expression and it′s mRNA(P<0.01) by inhibited the activation of glycogen synthase kinase 3(GSK3)β(P<0.01),but not induced the increase of phosphorylated β-Catenin(P<0.01).Besides,Wnt sigals pharmacology inhibitors PKF 115-584 can inhibit the gene expression of TGF-β1 induced collagen I α1(P<0.01) and ECM protein(including collagen I α1,fibronection,and versican) (P<0.01).ConclusionThe activation of Wnt/β-Catenin signaling pathway in HASMC(human airway smooth muscle cells),which involving the deposition of TFGβ1 induced ECM protein .

mgocytes,smooth muscle；extra cellular matrix；transforming growth factor β1；β-Catenin

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.001

廣東省自然科學基金資助項目(s2012010009036)；南方醫(yī)院院長基金資助項目(2014A001)。

：霍雅婷(1988-)，在讀碩士，主要從事哮喘氣道重塑研究。△

，Tel：(020)61641572；E-mail：drchengyx@126.com。

R562.25

A

1671-8348(2015)35-4897-03

2015-05-08

2015-07-11)