李 凡 謝 靜 英明中 曾 強(qiáng)

解放軍總醫(yī)院國(guó)際醫(yī)學(xué)中心，北京100853

血管緊張素Ⅱ和坎地沙坦對(duì)小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12胰島素敏感性的影響

李 凡 謝 靜 英明中 曾 強(qiáng)▲

解放軍總醫(yī)院國(guó)際醫(yī)學(xué)中心，北京100853

目的研究血管緊張素Ⅱ和坎地沙坦對(duì)小鼠骨骼肌細(xì)胞(C2C12)胰島素敏感性的影響及其機(jī)制。方法C2C12誘導(dǎo)分化成熟后，分為對(duì)照組(C組)、模型組(M組，AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦低劑量組(Can1組，坎地沙坦0.1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦中劑量組(Can2組，坎地沙坦1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦高劑量組(Can3組，坎地沙坦10μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)。各組細(xì)胞給予相應(yīng)藥物及胰島素處理后，使用二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成水平，使用2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，并用RT-PCR法和Western印跡法分別檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子-2(Nrf2)的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與C組比較，M組ROS生成水平顯著升高(P＜0.01)，攝取2-NBDG量顯著降低(P＜0.01);與M組比較，Can3組ROS生成水平顯著減少(P＜0.05)，攝取2-NBDG量則顯著增加(P＜0.05)。M組Nrf2的mRNA及蛋白表達(dá)較C組顯著降低(P＜0.01)，Can2組及Can3組Nrf2的mRNA及蛋白表達(dá)較M組顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)。結(jié)論AngⅡ通過(guò)下調(diào)C2C12中Nrf2的mRNA及蛋白表達(dá)，抑制Nrf2的抗氧化效應(yīng)，增加ROS生成，引起骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗;而坎地沙坦通過(guò)抑制AngⅡ的這種作用改善骨骼肌胰島素抵抗。

坎地沙坦;血管緊張素Ⅱ;胰島素抵抗;核轉(zhuǎn)錄因子-2;活性氧

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性下降，導(dǎo)致細(xì)胞攝取和利用葡萄糖的效率降低，為了維持血糖穩(wěn)定，機(jī)體代償性分泌過(guò)多胰島素造成高胰島素血癥的狀態(tài)。IR是高血壓與2型糖尿病的共同病理生理基礎(chǔ)，是兩者之間關(guān)聯(lián)性的重要指標(biāo)［1］。目前，已有多項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(angiotensinⅡ receptor blocker, ARB)類(lèi)降壓藥可改善高血壓患者的IR，從而降低該人群的2型糖尿病發(fā)病率［2-3］。本研究組之前的研究結(jié)果也顯示，ARB類(lèi)藥物中的坎地沙坦可以改善高血壓動(dòng)物模型的胰島素抵抗［4］。ARB的這種作用部分來(lái)源于對(duì)于細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的抑制［5,11］，但是其具體分子機(jī)制尚不清楚。由于骨骼肌是機(jī)體進(jìn)行葡萄糖代謝的主要器官，因此本研究以小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和坎地沙坦對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件的關(guān)鍵調(diào)控因子——Nrf2的影響，進(jìn)一步探討坎地沙坦改善骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗的分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下:

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠C2C12由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞資源中心提供。坎地沙坦、AngⅡ和2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)購(gòu)自Sigma公司，活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京碧云天公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara公司，Real-time PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京中原公司，Nrf2多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，HPR標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 C2C12的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及分組細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)按1∶4傳代。C2C12細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)，移除DMEM 10%胎牛血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基，換用含2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，每24小時(shí)換液1次，7 d后分化成為成熟骨骼肌細(xì)胞。細(xì)胞鑒定后進(jìn)行如下分組:對(duì)照組(C組，DMEM);模型組(M組，AngⅡ0.1μmol/L+DMEM);坎地沙坦低劑量組(Can1組)，坎地沙坦0.1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L+DMEM);坎地沙坦中劑量組(Can2組，坎地沙坦1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L+DMEM);坎地沙坦高劑量組(Can3組，坎地沙坦10μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L+DMEM)。

1.2.2 2-NBDG法檢測(cè)葡萄糖吸收率C2C12培養(yǎng)第8天，細(xì)胞換液為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基100μL。按實(shí)驗(yàn)分組依次加入坎地沙坦、AngⅡ和胰島素(10 nmol/L)，并使坎地沙坦終濃度符合分組要求。每一種藥物干預(yù)間隔時(shí)間為30min，并置于孵箱中。每組6個(gè)重復(fù)，無(wú)細(xì)胞為背景組。每孔細(xì)胞加入終濃度為150μg/mL 2-NBDG，孵育1h。室溫下，400 r/min離心培養(yǎng)板5min。小心吸去上清后每孔加入200μL的Cell based assay buffer細(xì)胞緩沖液。室溫下，400 r/min離心培養(yǎng)板5min，再每孔加入100μL的Cell based assay buffer細(xì)胞緩沖液。立即使用熒光分光光度計(jì)讀板分析，讀出細(xì)胞攝取的2-NBDG熒光值。激發(fā)光波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)535 nm。以C組的熒光值為基準(zhǔn)，各組與C組的比值為2-NBDG的攝取量，代表了細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。

1.2.3 二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)法檢測(cè)ROS水平對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12細(xì)胞接種于6孔板，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。去除細(xì)胞培養(yǎng)液后，每孔加入1mL稀釋好的DCFH-DA，37℃孵育30 min后，加入AngⅡ并使其終濃度為0.1μmol/L。30 min后按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度坎地沙坦，并使坎地沙坦終濃度符合分組要求，37℃孵育24 h后胰酶消化細(xì)胞并收集，1200 r/min離心3min，棄掉上清液。細(xì)胞溶于300μL的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，吹打成細(xì)胞懸液。每100μL加入到1個(gè)96孔板中，使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行讀板，檢測(cè)熒光值，以C組的熒光值為基準(zhǔn)，各組與C組的比值為ROS產(chǎn)生量。

1.2.4 Rea l-t ime PCR實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)成熟的C2C12換無(wú)血清DMEM，坎地沙坦、AngⅡ和胰島素按分組加入，每一種藥物干預(yù)間隔30 min，24 h后去除培養(yǎng)液，提取各組細(xì)胞總RNA，RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Nrf2引物由生工生物工程有限公司合成。引物設(shè)計(jì)如下:上游5＇-CAGCAGGACATGGATTTGAT-3＇，下游5＇-GCCTTCTCCTGTTCCTTCTG-3＇。于PCR反應(yīng)管內(nèi)加入，反應(yīng)總體積為20μL，其中上游及下游引物各0.5μL，cDNA1.5μL，SYBR Premix TaqTMⅡ10μL。于PCR儀(BIO-RAD，Inc)上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù):94℃2 min預(yù)變性;94℃15 s，60℃1 min，50個(gè)循環(huán)。獲取各組樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算機(jī)分析Ct值，以C組為基準(zhǔn)，與C組的比值為各組樣本Nrf2 mRNA的表達(dá)量。

1.2.5 Wes tern b l ot實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞的干預(yù)處理步驟同Real-time PCR實(shí)驗(yàn)。24 h后倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，從待測(cè)樣本中提取蛋白質(zhì)，使用Bradford法測(cè)定蛋白含量。各組取相同質(zhì)量的蛋白，變性后在聚丙烯酰胺凝膠上樣進(jìn)行電泳，電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉，先后加入Nrf2及內(nèi)參GAPDH的一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法(ECL法)顯色，X線(xiàn)片記錄結(jié)果，掃描蛋白條帶的密度并使用IPP軟件分析目的條帶灰度，以?xún)?nèi)參GAPDH灰度為基準(zhǔn)，與GAPDH的比值即為各組樣本Nrf2蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 12.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ和坎地沙坦對(duì)C2C12細(xì)胞攝取2-NBDG的影響

與C組比較，M組C2C12攝取2-NBDG水平顯著下降(P＜0.01)，提示AngⅡ能降低C2C12細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性;而給予坎地沙坦干預(yù)后，C2C12攝取2-NBDG水平升高，其中Can3組的2-NBDG攝取量較M組增加(P＜0.05)，提示高劑量坎地沙坦能改善AngⅡ?qū)2C12細(xì)胞攝取2-NBDG的抑制作用。見(jiàn)圖1。

圖1 AngⅡ和坎地沙坦對(duì)C2C12攝取2-NBDG的影響

2.2 AngⅡ和坎地沙坦對(duì)C2C12產(chǎn)生ROS的影響

與C組相比，M組C2C12內(nèi)ROS含量顯著升高(P＜0.01)。而給予坎地沙坦干預(yù)后，ROS生成有下降趨勢(shì)，其中Can3組的ROS含量顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示高劑量坎地沙坦能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。見(jiàn)圖2。

圖2 AngⅡ和坎地沙坦對(duì)C2C12產(chǎn)生ROS的影響

2.3 AngⅡ和坎地沙坦對(duì)N rf2mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，與C組比較，M組的Nrf2 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與M組比較，坎地沙坦各組的Nrf2 mRNA表達(dá)均呈上升趨勢(shì)。其中，Can2組及Can3組與M組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 AngⅡ和坎地沙坦對(duì)Nrf2m RNA表達(dá)的影響

2.4 AngⅡ和坎地沙坦對(duì)N rf2蛋白表達(dá)的影響

Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組比較，M組的Nrf2蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.01);與M組比較，3個(gè)坎地沙坦組的Nrf2蛋白表達(dá)量有升高趨勢(shì)。其中，Can2組及Can3組與M組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見(jiàn)圖4～5。

圖4 AngⅡ和坎地沙坦對(duì)Nrf2蛋白表達(dá)的影響

圖5 AngⅡ和坎地沙坦對(duì)Nrf2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來(lái)，隨著對(duì)ROS族研究的深入，證實(shí)了大量ROS的產(chǎn)生是導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的重要機(jī)制之一，而氧化應(yīng)激損害在形成胰島素抵抗的病理生理過(guò)程中起重要作用［6,7］。有研究表明，正常個(gè)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞會(huì)通過(guò)活化抗氧化系統(tǒng)分子信號(hào)通道來(lái)增加抗氧化酶類(lèi)的生成，以應(yīng)對(duì)ROS生成的增加。而對(duì)于高血壓的個(gè)體，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的分子信號(hào)反應(yīng)能力下降，則只會(huì)加重ROS介導(dǎo)的胰島素信號(hào)通路損害，加重IR［12］。本研究中，通過(guò)給予C2C12一定濃度的AngⅡ，觀察到M組C2C12內(nèi)ROS表達(dá)顯著增加，而該組細(xì)胞的2-NBDG攝取顯著下降，出現(xiàn)了IR。因此，本研究組認(rèn)為高血壓個(gè)體中腎素-血管緊張素系統(tǒng)過(guò)度激活提高了AngⅡ的水平，這在一定程度上影響了骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激平衡，這與Xin等［8］研究結(jié)果一致，其原因可能與AngⅡ增加細(xì)胞內(nèi)NAD(P)H氧化酶表達(dá)有關(guān)。

目前研究認(rèn)為，Nrf2是細(xì)胞抗內(nèi)源性氧化應(yīng)激的重要中樞調(diào)節(jié)者，在細(xì)胞介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激防御反應(yīng)中具有重要的作用［13］。因此，高血壓狀態(tài)下細(xì)胞抗氧化能力下降，以及由此產(chǎn)生的胰島素信號(hào)通路損害，很可能與Nrf2的功能異常有關(guān)。結(jié)合研究組之前的研究，本研究組認(rèn)為高血壓狀態(tài)下AngⅡ的過(guò)度表達(dá)會(huì)造成ROS在骨骼肌的過(guò)度表達(dá)［9］。但是，ARB類(lèi)藥物改善糖代謝、降低骨骼肌胰島素抵抗的效應(yīng)是否與Nrf2在骨骼肌內(nèi)表達(dá)的改變有關(guān)尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

在正常情況下，內(nèi)源性抗氧化物酶［如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等］是防止氧化應(yīng)激產(chǎn)生細(xì)胞損傷的第一道防線(xiàn)，這些內(nèi)源性抗氧化物酶通過(guò)清除過(guò)量ROS來(lái)平衡機(jī)體內(nèi)的氧化過(guò)程［10］，而產(chǎn)生這一生物抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的防御機(jī)制主要是通過(guò)抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)。ARE是許多抗氧化基因上游中的順式作用增強(qiáng)元件，而Nrf2正是通過(guò)介導(dǎo)ARE參與調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白而發(fā)揮作用［14］。在正常情況下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)偶聯(lián)，并與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)合錨定于質(zhì);當(dāng)受到ROS或其他親核劑信號(hào)攻擊后，Nrf2與Keapl解偶聯(lián)后被激活轉(zhuǎn)位進(jìn)人細(xì)胞核中，與Maf蛋白結(jié)合成異二聚體，異二聚體與基因中的ARE結(jié)合后激活了Nrf2/ARE信號(hào)通路以及其下游的抗氧化蛋白，有效清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基,發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［15］。因此，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Nrf2表達(dá)下調(diào)時(shí)，無(wú)法正常介導(dǎo)ARE的抗過(guò)氧化調(diào)控作用，使得細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)增加。

本研究表明，在AngⅡ存在的狀況下，M組C2C12細(xì)胞內(nèi)的Nrf2的表達(dá)受到抑制，ROS生成增加，胰島素敏感性減低。給予坎地沙坦處理可以有效對(duì)抗這種抑制作用，顯著增加Nrt2的表達(dá)，同時(shí)ROS的水平下降，IR得到改善。以上結(jié)果提示坎地沙坦通過(guò)對(duì)AngⅡ的抑制上調(diào)了Nrf2的表達(dá)，繼而通過(guò)Nrf2/ARE途徑發(fā)揮對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用，使細(xì)胞內(nèi)ROS有所降低，減輕了ROS對(duì)胰島素分子信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，恢復(fù)和改善由于ROS過(guò)度增加而損害的PI3K、Akt等胰島素信號(hào)傳導(dǎo)分子的磷酸化功能，從而使胰島素能發(fā)揮正常的促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖的功能。

綜合上所述，坎地沙坦對(duì)骨骼肌細(xì)胞胰島素敏感性的保護(hù)機(jī)制部分來(lái)源于減少AngⅡ?qū)rf2表達(dá)的抑制作用。但是Nrf/ARE的抗氧化機(jī)制比較復(fù)雜，還有待于進(jìn)一步研究以得到更多的證據(jù)支持。

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Effects of Angiotensin Ⅱ and Candesartan on insulin sensitivity of mouse C2C12 myotubes

LI Fan XIE Jing YING Mingzhong ZENG Qiang▲
International Medical Center,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China

Objective To investigate the effects of Candesartan and Angiotensin Ⅱ (AngⅡ)on insulin sensitivity of mouse C2C12 myotubes,and discuss the possible mechanism.MethodsMature C2C12 myotubes were divided into 4 groups:control group(group C),model group(group M,AngⅡ0.1μmol/L),low dose Candesartan group(Can1 group, Candesartan 0.1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L),mild dose Candesartan group(Can2 group,Candesartan 1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)and high dose Candesartan group(Can3 group,Candesartan 10μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L).After the intervention of angiotensinⅡand insulin,the uptake of 2-deoxyglucose(2-NBDG)by C2C12 myotubes was measured in each group as well as the level of reactive oxygen species(ROS).The mRNA and protein expression of Nrf2 were measured by RT-PCR and Western blotting assay.ResultsCompared with the group C,the uptake of 2-NBDG in the group M was significantly decreased(P＜0.01),the mRNA and protein expression of Nrf2 in group M was significantly decreased(P＜0.01),at the same time,the level of ROS was increased significantly(P＜0.01).Compared with group M,the uptake of 2-NBGD was increased obviously in Can3 group(P＜0.05).The mRNA and protein expression of Nrf2 in group M were decreased than those in group C(P＜0.01),the mRNA and protein expression of Nrf2 in the Can2 group and Can3 group were significantly increased than those in group M(P＜0.01 or P＜0.05).ConclusionAngiotensin Ⅱ can cause the insulin resistance of the skeletal muscle cells by reducing the mRNA and protein expression of Nrf2,controling Nrf2 oxidation effect,increasing ROS produce;Candesartan can improve skeletal muscle cells insulin resistance by reverse the effect of Ang Ⅱ on Nrf2 and improve the overload of ROS in the cells.

Candesartan;AngiotensionⅡ,Insulin resistance;Nrf2;Reactive oxygen species

R544.1

A

1673-7210(2015)03(a)-0014-05

2014-11-10本文編輯:蘇暢)

北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)7122171)。

▲通訊作者