朱世振+邱波+高明勇+宋其合+門海龍

[摘要] 目的 探討血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）對軟骨細胞凋亡的影響。 方法 乳鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞體外培養(yǎng)成功后，實驗分為三組。每組加入不同處理因素進行干預(yù)，對照組：不加任何處理因素；VEGF組：VEGF 10 ng/mL；白介素（IL）-1β組： IL-1β 10 ng/mL，連續(xù)培養(yǎng)48 h。采用流式細胞儀檢測軟骨細胞的凋亡率，采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白的表達，通過硝酸還原酶法檢測上清液中一氧化氮（NO）的含量。 結(jié)果 軟骨細胞的凋亡率VEGF組[（9.28±2.35）%]及IL-1β組[（17.14±5.07）%]明顯高于對照組[（2.83±0.77）%]；軟骨細胞PCNA蛋白表達VEGF組（0.86±0.24）及C組（0.72±0.05）明顯低于對照組（1.01±0.11）；軟骨細胞分泌的NO含量VEGF組[（112.31±12.73）μmol/L]及IL-1β組[（150.02±15.34）μmol/L]顯著高于對照組[（49.35±6.68）μmol/L]，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 VEGF能夠介導(dǎo)軟骨細胞凋亡，抑制軟骨細胞的增殖活性。

[關(guān)鍵詞] 血管內(nèi)皮生長因子；骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細胞；凋亡

[中圖分類號] R684.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（a）-0004-04

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡和細胞外基質(zhì)進行性降解為主要病理特征的疾病。OA的病因尚不完全清楚，研究證實OA受累軟骨和滑膜中已發(fā)現(xiàn)多種血管生成介質(zhì)，其中血管內(nèi)皮生長子（vascular endothelia growth factor，VEGF）是血管生成的主要調(diào)節(jié)因子，探討VEGF在關(guān)節(jié)軟骨中退變的作用，特別是以VEGF為靶向的骨關(guān)節(jié)炎疾病的治療是研究的熱點之一。本實驗探討VEGF對軟骨細胞凋亡，以及對增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達和一氧化氮（nitric oxide，NO）含量的影響，為今后以VEGF為靶點治療骨關(guān)節(jié)炎提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供的出生1周齡的SD級乳鼠10只，雌雄不分，體重（100±10）g。DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（美國Hyclone公司），胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司），細胞總蛋白提取試劑盒（武漢谷歌生物），PCNA一抗，Annexin-FITC細胞凋亡試劑盒，NO檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗方法

1.2.1 軟骨細胞的體外培養(yǎng)和分離 將乳鼠處死后，75%乙醇浸泡，取其膝關(guān)節(jié)軟骨，并無菌條件下移至加有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，剪碎至1 mm3大小，依次用0.25%胰蛋白酶37℃消化40 min，1000 r/min離心5 min后，棄上清，用PBS洗3遍，再加入0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃消化2 h，細胞接種于DMEM/F12培養(yǎng)基，并補充100 mL/L胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，密度為2×105接種于培養(yǎng)板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞70%～80%融合后，培養(yǎng)基中分別加入不同干預(yù)因素。實驗分三組，對照組：不加任何處理因素；VEGF組：10 ng/mL VEGF；C組：10 ng/mL IL-1β，每組設(shè)4個復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)48 h進行檢測。

1.2.2 流式細胞技術(shù)檢測軟骨細胞凋亡 用0.25%胰酶將各組貼壁細胞從培養(yǎng)板上消化并分別收集至2 mL EP管中，將各組細胞用1 mL PBS洗滌一遍，最后各組分別加入5 μL Annexin-FITC、10 μL碘化丙啶，室溫避光孵育15 min，上機檢測，重復(fù)5次。

1.2.3 Western Blot法檢測軟骨細胞PCNA的表達 6孔板鋪軟骨細胞2×105孵育過夜，加入以上干預(yù)因素，24 h后，加入細胞裂解液100 μL裂解細胞，按常規(guī)的Western Blot操作方法進行，冰上裂解5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清行BCA蛋白定量；取樣品約10 μg行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（兔抗PCNA單克隆抗體，1∶1000），4℃過夜；PBS漂洗3次每次10 min，加入HRP標記羊抗兔二抗（1∶3000），室溫孵育1 h，漂洗3次，用ECL顯色液曝光，灰度掃描儀進行定量分析。

1.2.4 硝酸還原酶法檢測軟骨細胞分泌NO的含量 NO是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的小分子物質(zhì)，是一種自由基，NO在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)變?yōu)镹O2-和NO3-，而NO2-又將很快轉(zhuǎn)變?yōu)镹O3-，本法利用硝酸還原酶的特性將NO3-還原為NO2-來檢測NO的含量。根據(jù)南京建成公司提供的硝酸還原酶檢測試劑盒，通過測定550 nm處的吸光光度值，對各組細胞上清液中NO的含量進行檢測。NO（μmol/L）=（測定管吸光度值-空白管吸光度值/標準管吸光度-空白管吸光度值）×標準品濃度（100 μmol/L）×樣品測試前稀釋倍數(shù)

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞術(shù)檢測軟骨細胞凋亡情況

對照組軟骨細胞凋亡率[（2.83±0.77）%]明顯低于VEGF組[（9.28±2.35）%]和IL-1β組[（17.14±5.07）%]，三組差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（F = 56.145，P < 0.01）。進一步組間比較，VEGF組和IL-1β組分別與對照組比較，VEGF組與IL-1β組比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），顯示IL-1β與VEGF具有促進軟骨細胞凋亡的作用，IL-1β促凋亡作用更明顯。見圖1。

2.2 軟骨細胞PCNA蛋白的表達

對照組軟骨細胞PCNA蛋白表達[（1.01±0.11）]明顯高于VEGF組[（0.86±0.24）]及IL-1β組[（0.72±0.05）]，三組間差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（F=91.99，P < 0.01）。進一步組間比較，VEGF組與對照組比較，IL-1β組與對照組比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），VEGF組與IL-1β組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 NO含量的檢測

軟骨細胞上清液中NO含量VEGF組[（112.31±12.73）μmol/L]和IL-1β處理組[（150.02±15.34）μmol/L]明顯高于對照組[（49.35±6.68）μmol/L]，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。進一步組間比較，VEGF組與對照組比較，IL-1β組與對照組比較，VEGF組和IL-1β組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。

3 討論

研究認為OA軟骨退變與細胞因子、基質(zhì)降解酶、細胞凋亡等密切相關(guān)。IL-1β被認為是介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨破壞最直接的細胞因子。IL-1β可以通過上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶-2的表達，誘導(dǎo)NO和前列腺素E2的產(chǎn)生，而NO和前列腺素E2均是促進分解的重要因子。IL-1β能夠刺激軟骨細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（metalloproteinases，MMPs），加速軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的降解，進而破壞軟骨細胞外基質(zhì)的完整性及組織的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。本研究用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞以模擬OA軟骨細胞病理學(xué)改變，結(jié)果顯示，與對照組組比較，IL-1β能刺激軟骨細胞，產(chǎn)生大量NO，IL-1β處理組軟骨細胞凋亡率較正常組明顯增高（P < 0.01），顯示用IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞符合OA體外研究模型，能夠模擬OA體外軟骨細胞的病理學(xué)特點[1]。

VEGF是血管生成的重要介質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，血管發(fā)生參與了OA的發(fā)病機制，血管發(fā)生與OA滑膜炎、軟骨丟失、軟骨下骨重塑和骨贅形成密切相關(guān)。在眾多影響血管發(fā)生的因子中VEGF的作用最為重要。關(guān)節(jié)軟骨細胞表達VEGF數(shù)量增多，導(dǎo)致微小血管從軟骨下骨向軟骨不斷長入。微小血管釋放的促凋亡因子可以引起肥大層軟骨細胞的凋亡。骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨組織中促血管生成因子（如VEGF）的數(shù)量明顯增加，而抗血管生成因子的數(shù)量明顯減少，軟骨組織血管生成因子和促血管生成因子的平衡被破壞，結(jié)果導(dǎo)致血管從軟骨下骨長入到關(guān)節(jié)軟骨中，在軟骨內(nèi)成骨中扮演重要角色，從而進一步加劇了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[2]。此外，VEGF在OA軟骨組織中的表達明顯增高[3]。OA患者的關(guān)節(jié)軟骨組織表達VEGF的細胞數(shù)量明顯多于健康對照組[4]。在OA模型中發(fā)現(xiàn)類似血管翳樣組織，彩色多普勒發(fā)現(xiàn)OA關(guān)節(jié)軟骨上的血管翳和組織學(xué)觀察到的血管增生一致[5]。VEGF能夠促進MMPs的分泌，減少基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）的產(chǎn)生，從而改變了MMPs/TIMPs的平衡，促進軟骨基質(zhì)降解[6-7]。Ludin等[8]發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)腔注射VEGF能夠引起關(guān)節(jié)軟骨退變，導(dǎo)致OA的發(fā)生，認為VEGF是OA的重要致病因素。VEGF拮抗劑sFlt-1治療骨關(guān)節(jié)炎組軟骨細胞凋亡降低，軟骨細胞增殖水平增加，提示VEGF能夠介導(dǎo)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡，抑制軟骨細胞增殖，VEGF對關(guān)節(jié)軟骨細胞代謝的調(diào)節(jié)有重要作用[9]。VEGF參與了OA的病理改變過程，在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，以VEGF為靶點成為OA的治療策略之一[10]。

細胞的凋亡，即程序性的死亡，對于細胞正常的生長和更新以及受損傷細胞的移除是十分重要的。正常軟骨細胞凋亡發(fā)生率較低，骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中有過度的軟骨細胞凋亡，凋亡可發(fā)生于軟骨全層，在OA模型中，可以觀察到軟骨細胞的凋亡較正常組明顯增多[1，11]，而軟骨細胞的凋亡是導(dǎo)致OA軟骨細胞減少的主要原因。OA患者關(guān)節(jié)軟骨細胞中有典型的細胞凋亡，而且細胞凋亡的數(shù)量與OA分級明顯相關(guān)，軟骨細胞的凋亡與OA的進展密切相關(guān)。軟骨細胞凋亡的機制目前仍不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)NO是一種重要的誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡的因子，在OA的發(fā)病機制中起到非常重要的作用[12]。NO合成酶可以介導(dǎo)軟骨細胞產(chǎn)生大量NO，NO能夠?qū)е萝浌羌毎蛲龅臄?shù)量明顯增加。OA軟骨細胞凋亡數(shù)量與亞硝酸鹽產(chǎn)生的水平、OA分級呈明顯相關(guān)性。NO的產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)軟骨細胞的凋亡，軟骨細胞受到損傷后，抑制NO的產(chǎn)生可能阻止骨關(guān)節(jié)炎早期病程的進展，表明NO可誘發(fā)軟骨細胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，IL-1β處理組和VEGF處理組軟骨細胞的凋亡率較正常組明顯增高，顯示IL-1β和VEGF對軟骨細胞均有促凋亡作用，IL-1β的作用更強。同時發(fā)現(xiàn)VEGF和IL-1β干預(yù)的軟骨細胞分泌的NO含量明顯高于正常組，提示VEGF和IL-1β可能通過增加NO介導(dǎo)軟骨細胞凋亡。

PCNA是一種分子量為36000，在細胞周期中參與DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)。它是DNA聚合酶的輔助因子，在S期參與DNA的復(fù)制，并作為細胞增殖狀態(tài)的重要標志物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF組和IL-1β組中的PCNA蛋白表達量均低于正常組，說明VEGF和IL-1β有降低軟骨細胞的增殖活性的作用。

綜上述，本研究結(jié)果顯示VEGF能夠介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡，抑制軟骨細胞的增殖活性，VEGF可能通過增加NO介導(dǎo)軟骨細胞凋亡。

[參考文獻]

[1] 閆虎，蘇友新，林學(xué)義.IL-1β誘導(dǎo)新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)退變軟骨細胞的體外培養(yǎng)及鑒定[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（1）：81-86.

[2] Carlevaro MF，Cermelli S，Cancedda R，et al. Vascular endothelial growth factor （VEGF） in cartilage neovascularization and chondrocyte differentiation：auto-paracrine role during endochondral bone formation [J]. J Cell Sci，2000， 113（1）：59-69.