趙祥穎，張立鶴，楊麗萍，韓延雷，田延軍，張家祥，劉建軍

(山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東濟(jì)南，250013)

赤蘚糖醇是一種新型的功能性多元醇類甜味劑，甜味特征與蔗糖相似，而熱量卻接近零，作為甜味劑和填充劑在食品中添加可避免蔗糖或葡萄糖等糖品帶來(lái)的高熱量、糖尿病不適、致齲齒等困擾［1-2］。赤蘚糖醇作為一種天然產(chǎn)物廣泛存在于真菌(如海藻、蘑菇等)、水果(梨、甜瓜、葡萄等)以及各類發(fā)酵食品中(如葡萄酒、清酒、醬油、干酪等)，在人或動(dòng)物的血液、尿液中也可檢測(cè)到該成分［3-4］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，赤蘚糖醇食用安全無(wú)毒［1］，因?yàn)槠浒踩院蛢?yōu)越的加工性能，商品赤蘚糖醇1990年一經(jīng)面市就受到食品加工行業(yè)的歡迎，可作為香味促進(jìn)劑、保濕劑、穩(wěn)定劑、增稠劑等替代蔗糖在各種食品和飲料中添加［5］。此外，研究證明它還具有清除自由基抗氧化活性，可以預(yù)防高血糖癥對(duì)血管壁的傷害［6］。

商品赤蘚糖醇是以葡萄糖為原料，經(jīng)耐高滲酵母菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化生成。雖然，已經(jīng)面市多年，但與其生產(chǎn)相關(guān)的研究依然活躍［7-10］，研究?jī)?nèi)容主要集中在菌種的篩選和工藝條件的優(yōu)化，而對(duì)生產(chǎn)下游技術(shù)的和副產(chǎn)物的研究相對(duì)較少［11］。赤蘚糖醇的生產(chǎn)下游提取工藝為:發(fā)酵液經(jīng)菌體分離、脫色、凈化、濃縮結(jié)晶、再經(jīng)重結(jié)晶精制［12］，重結(jié)晶母液返回工序循環(huán)利用，一次結(jié)晶母液經(jīng)多次濃縮回收赤蘚糖醇后廢棄。廢棄母液是赤蘚糖醇生產(chǎn)中主要副產(chǎn)物之一，每生產(chǎn)1t赤蘚糖醇就會(huì)產(chǎn)生大約0.8～1 m3廢棄母液，因?yàn)槿狈τ行У奶幚矸椒ǎa(chǎn)企業(yè)現(xiàn)一般將母液作為污水處理排放，即浪費(fèi)了資源，又增加了環(huán)境污染負(fù)荷和企業(yè)污水處理費(fèi)用。作者等人［11］曾就回收母液中的赤蘚糖醇進(jìn)行研究，在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)母液中除赤蘚糖醇外，還含有另外兩種未知組分，初步分析認(rèn)為這兩種組分應(yīng)是赤蘚糖醇發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的其他多元糖醇產(chǎn)物。本研究擬對(duì)這兩種未知糖醇組分進(jìn)行鑒定，為赤蘚糖醇母液的進(jìn)一步資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

赤蘚糖醇母液由山東濱州三元生物科技有限公司提供。赤蘚糖醇標(biāo)準(zhǔn)品，由本實(shí)驗(yàn)室用商品赤蘚糖醇精制，純度99.9%。其他試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)從試劑公司購(gòu)買。色譜柱:氨基柱(填料:Hypersil NH25μm，尺寸:4.6 mm ×250 mm)，大連依利特分析儀器有限公司;糖分析柱(Shodex SC1011，鈣型，8.0mm ×300 mm)，昭和電工科學(xué)儀器(上海)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

UlitiMate3000標(biāo)準(zhǔn)型高效液相色譜儀，戴安(中國(guó))有限公司;RI230型示差折光檢測(cè)器，昭和電工科學(xué)儀器有限公司。

1.3 分析測(cè)定方法

1.3.1 HPLC 糖醇分析條件

赤蘚糖醇生產(chǎn)母液，經(jīng)脫色、除離子等凈化處理后，配制成固形物1% ～2%的樣品進(jìn)樣。其他標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成約1%的濃度進(jìn)樣。

氨基柱色譜條件:流動(dòng)相為80∶20的乙腈和水，流速 0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫60 ℃。

糖分析柱色譜條件:流動(dòng)相為去離子水，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫 80 ℃。

1.3.2 液質(zhì)聯(lián)用分析

赤蘚糖醇母液液質(zhì)聯(lián)用分析數(shù)據(jù)，是委托相關(guān)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)所得。

2 結(jié)果與分析

2.1 母液預(yù)處理及標(biāo)準(zhǔn)糖醇的選擇

本文分析使用的赤蘚糖醇母液是生產(chǎn)母液經(jīng)活性碳脫色、離子交換脫鹽、濃縮結(jié)晶回收赤蘚糖醇后所得母液［11］。母液HPLC氨基柱色譜圖如圖1。

圖1 赤蘚糖醇母液的HPLC色譜圖(氨基柱)Fig.1 The HPLC chromatogram of erythritol mother liquor(NH2column)

有關(guān)赤蘚糖醇發(fā)酵副產(chǎn)物的報(bào)道并不多見(jiàn)，報(bào)道的主要是甘油［10，14-15］，只有一篇文獻(xiàn)提到副產(chǎn)物中含有核糖醇［15］。另外，文獻(xiàn)中報(bào)道微生物合成的多元醇還有阿拉伯糖醇［16］、甘露糖醇［17］、山梨糖醇［18］和木糖醇［19］等。因此，本文選取甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇7種多元醇為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用高效液相色譜(HPLC)和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)對(duì)赤蘚糖醇母液的未知糖醇組分進(jìn)行定性鑒定。

2.2 氨基柱HPLC分析

圖2為7種混合糖醇氨基柱色譜圖?；旌咸谴紭悠泛?種糖醇，采用氨基柱分析，譜圖中只有4個(gè)物質(zhì)峰，保留時(shí)間分別為 6.542、7.420 、8.283 和9.331 min，說(shuō)明混合糖醇樣品中，不同糖醇的保留時(shí)間有重疊。對(duì)比單一糖醇樣品氨基柱色譜分析結(jié)果可知，6.542 min 峰為甘油，7.420 min 峰為赤蘚糖醇;木糖醇、阿拉伯糖醇和核糖醇保留時(shí)間相同(均在8.3 min 左右)，因此，8.283 min應(yīng)為3 種五碳糖醇的疊加峰;甘露糖醇和山梨糖醇保留時(shí)間相同，圖2中9.331 min峰應(yīng)是這兩種六碳糖醇的疊加峰。母液氨基柱色譜圖(圖1)中有3個(gè)峰，保留時(shí)間分別為7.420、8.277 和 9.260 min，沒(méi)有和甘油保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)的峰，可以確定母液中不含甘油成分;譜圖中7.420 min位置峰與標(biāo)準(zhǔn)赤蘚糖醇對(duì)應(yīng)，確定為赤蘚糖醇成分。母液譜圖中 8.277 min峰(未知峰Ⅰ)與木糖醇、阿拉伯糖醇和核糖醇保留時(shí)間基本一致，母液譜圖9.260 min位置峰(未知峰Ⅱ)，與甘露糖醇和山梨糖醇保留時(shí)間一致，因?yàn)楸Ａ魰r(shí)間重疊，因此，僅采用氨基柱HPLC分析，不能將兩未知成分定性。

圖2 混合糖醇標(biāo)樣的HPLC色譜圖(氨基柱)Fig.2 The HPLC chromatograms of mixed sugar alcohol(NH2column)

2.3 糖分析柱HPLC分析

氨基柱分析結(jié)果排除了甘油，而木糖醇、阿拉伯糖醇和核糖醇3種五碳糖醇保留時(shí)間與母液中的未知峰Ⅰ一致，甘露糖醇和山梨糖醇兩種六碳糖醇保留時(shí)間與母液中未知峰Ⅱ一致，未能將兩未知成分定性。為了進(jìn)一步區(qū)分阿拉伯糖醇、核糖醇和木糖醇，甘露糖醇和山梨糖醇，本文又選用糖分析專用柱(Shodex SC1011)對(duì)母液成分進(jìn)行進(jìn)一步分析。

母液糖分析柱譜圖如圖3。圖中顯示有3個(gè)物質(zhì)峰，保留時(shí)間分別為 10.629、11.01 和 13.107 min。標(biāo)準(zhǔn)糖醇的單一糖分析柱分析保留時(shí)間分別為:赤蘚糖醇 11.01 min，阿拉伯糖醇 13.319 min，核糖醇10.587 min，木糖醇 15.964 min，甘露糖醇 13.321 min，山梨糖醇16.532 min。比較母液色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)糖醇保留時(shí)間可以發(fā)現(xiàn)，母液色譜圖中沒(méi)有與木糖醇和山梨糖醇對(duì)應(yīng)的物質(zhì)峰，因此，可以確定母液中不含木糖醇和山梨糖醇成分，結(jié)合氨基柱分析結(jié)果，可以初步確定母液中應(yīng)含有阿拉伯醇和甘露糖醇組分。圖3中峰2與赤蘚糖醇保留時(shí)間一致，可以確定為赤蘚糖醇。圖3中峰1保留時(shí)間與核糖醇接近，通過(guò)外加核糖醇分析，譜圖中(圖4)沒(méi)有出現(xiàn)新的色譜峰，而峰1響應(yīng)值明顯升高，可以推定峰1為核糖醇成分。糖分析柱色譜阿拉伯糖醇和甘露糖醇保留時(shí)間非常接近，并且與峰3保留時(shí)間基本一致，所以峰3可能是阿拉伯糖醇或甘露糖醇或它們的混合物。

圖3 赤蘚糖醇母液HPLC色譜圖(Shodex SC1011色譜柱)Fig.3 The HPLC chromatograms of mother liquor(Shodex SC1011 column)

圖4 母液外加核糖醇HPLC色譜圖(Shodex SC1011色譜柱)Fig.4 The HPLC chromatograms of mother liquor and ribitol(Shodex SC1011 column)

2.4 母液未知組分定性

母液氨基柱色譜分析，未知峰Ⅰ可能是核糖醇、阿拉伯糖醇或木糖醇一種或幾種，結(jié)合糖分析柱色譜結(jié)果，可以排除木糖醇的存在。通過(guò)比較母液兩柱譜圖(圖1和圖3)，可以發(fā)現(xiàn)未知峰Ⅰ面積遠(yuǎn)大于圖3中的核糖醇峰(峰1)，所以未知峰Ⅰ不可能只含有核糖醇成分，應(yīng)該是核糖醇與阿拉伯糖醇的混合物，并且以阿拉伯糖醇為主。母液氨基柱色譜分析，未知峰Ⅱ可能為山梨糖醇或甘露糖醇或兩者的混合物，而糖分析柱色譜排除了山梨糖醇，所以未知峰Ⅱ應(yīng)為甘露糖醇。再通過(guò)比較兩譜圖中的赤蘚糖醇峰、未知峰Ⅱ(甘露糖醇)和峰3的面積，可以發(fā)現(xiàn)，氨基柱分析母液中甘露糖醇(未知峰Ⅱ)與赤蘚糖醇相當(dāng)，而糖分析柱分析結(jié)果顯示峰3的面積明顯比赤蘚糖醇大，因此，可以推斷峰3應(yīng)是阿拉伯糖醇和甘露糖醇的混合物。

根據(jù)以上分析結(jié)果，基本可以推斷赤蘚糖醇母液中的未知糖醇成分主要是阿拉伯糖醇甘露糖醇以及少量的核糖醇。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HPLC分析結(jié)果，本文又采用LC-MS對(duì)母液中各組分的分子量進(jìn)行了測(cè)定。

2.5 液質(zhì)聯(lián)(LC-MS)分析

LC-MS分析液相采用氨基柱。圖5為母液質(zhì)譜總離子流量圖。圖中給出3種物質(zhì)［M+Na］+信號(hào)的質(zhì)荷比(m/z)分別為 145.035 3、175.058 2 和205.079 4，據(jù)此可以推斷出3種物質(zhì)的分子質(zhì)量分別為122、152和182，與赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇(核糖醇)和甘露糖醇分子質(zhì)量一致，進(jìn)一步證實(shí)了HPLC分析結(jié)果。另外，圖中質(zhì)荷比(m/z)為175.0582的主峰(對(duì)應(yīng)分子量為152)左側(cè)有小峰，推測(cè)主峰應(yīng)為阿拉伯糖醇，小峰應(yīng)為核糖醇。

圖5 母液的LC-MS譜圖Fig.5 The LC-MS chromatograms of mother liquor

3 討論

本文通過(guò)HPLC以及LC-MS分析對(duì)赤蘚糖醇生產(chǎn)母液中的兩種未知成分進(jìn)行定性鑒定，結(jié)果顯示，赤蘚糖醇母液含有的未知糖醇成分主要是阿拉伯糖醇和甘露糖醇，另外，還含有少量的核糖醇。

目前糖和糖醇定性和定量分析主要采用HPLC分析，色譜柱主要選用糖分析柱(陽(yáng)離子交換柱)［20］和氨基柱［21-22］，檢測(cè)器一般為示差折光檢測(cè)器。本文采用HPLC分析對(duì)赤蘚糖醇生產(chǎn)母液中的未知糖醇成分進(jìn)行定性鑒定。首先選用氨基柱對(duì)赤蘚糖醇母液進(jìn)行分析，分離出3種主要組分，赤蘚糖醇、五碳糖醇(阿拉伯糖醇、核糖醇、木糖醇)和六碳糖醇(甘露糖醇、山梨糖醇)。因?yàn)?，同分異?gòu)體的五碳糖醇以及六碳糖醇糖在氨基柱的保留時(shí)間基本相同，所以單純使用氨基柱未能對(duì)母液中的兩種未知成分定性。本文隨后又用糖分析柱(陽(yáng)離子交換柱)對(duì)母液進(jìn)行了分析，也分離出3種成分，通過(guò)與糖醇標(biāo)準(zhǔn)物比較，鑒定出母液中含有核糖醇成分，并排除了木糖醇和山梨糖醇的存在，結(jié)合氨基柱分析結(jié)果，推斷出母液中的六碳糖醇應(yīng)為甘露糖醇。最后通過(guò)比較兩次分析中核糖醇峰面積與五碳糖醇峰面積，推斷出母液中還應(yīng)含有阿拉伯糖醇，并且阿拉伯糖醇含量要遠(yuǎn)大于核糖醇，質(zhì)譜分析也佐證了這一結(jié)果。通過(guò)以上分析可以發(fā)現(xiàn)，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)糖醇保留時(shí)間有重疊，單獨(dú)采用氨基柱或糖柱HPLC分析都未能對(duì)赤蘚糖醇母液未知組分進(jìn)行定性，通過(guò)兩色譜柱的分析結(jié)果相互印證，以及質(zhì)譜分子量的測(cè)定，才最終完成了對(duì)赤蘚糖醇母液未知糖醇的定性鑒定。

本文研究用母液來(lái)自赤蘚糖醇的生產(chǎn)企業(yè)。赤蘚糖醇下游提取工藝均為物理過(guò)程，過(guò)程中不可能產(chǎn)生新的糖醇物質(zhì)，所以母液中鑒定出的阿拉伯糖醇、甘露糖醇和核糖醇應(yīng)是赤蘚糖醇發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。赤蘚糖醇生產(chǎn)發(fā)酵液HPLC分析(氨基柱)顯示，發(fā)酵液中有少量副產(chǎn)物存在(生產(chǎn)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，未列出)，因?yàn)楦碑a(chǎn)物含量較低，加之發(fā)酵液成分復(fù)雜，直接進(jìn)行副產(chǎn)物分析鑒定難度較大。而母液是發(fā)酵液經(jīng)凈化除雜、濃縮結(jié)晶分離赤蘚糖醇后剩余的料液，在此過(guò)程中這些多元醇副產(chǎn)物經(jīng)多次濃縮，濃度大幅度提高，同時(shí)料液也被徹底凈化，所以采用母液對(duì)這些副產(chǎn)物鑒定反而比較容易，特別是核糖醇這樣含量比較少的副產(chǎn)物。

高滲酵母產(chǎn)多元醇的研究最常見(jiàn)的副產(chǎn)物的主要是甘油，赤蘚糖醇發(fā)酵產(chǎn)甘油也有報(bào)道［10，14-15］，Lin等研究叢梗孢酵母(Moniliella)赤蘚糖醇發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)，副產(chǎn)物中除甘油外還含有核糖醇，副產(chǎn)物產(chǎn)率約占總糖醇產(chǎn)率的1/4［15］。耐高滲酵母以葡萄糖為底物，可以轉(zhuǎn)化生成阿拉伯糖醇，也常伴有大量甘油副產(chǎn)物［23］。微生物產(chǎn)甘露糖醇主要有乳酸菌和酵母菌［17］，最近有報(bào)道耶氏解脂酵母酵母利用甘油為底物，發(fā)現(xiàn)有甘露糖醇副產(chǎn)物［7，24］，但未見(jiàn)有以葡萄糖為底物赤蘚糖醇發(fā)酵產(chǎn)阿拉伯糖醇和甘露糖醇副產(chǎn)物的文獻(xiàn)報(bào)道。

本文通過(guò)HPLC和LC-MS分析，首次鑒定出赤蘚糖醇生產(chǎn)母液中含有阿拉伯糖醇、甘露糖醇和少量核糖醇，不含其他雜質(zhì)。這幾種多元糖醇都是食品用多元糖醇常見(jiàn)品種，這為母液資源化開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。本研究明確了生產(chǎn)中赤蘚糖醇發(fā)酵多元醇副產(chǎn)物的種類和含量，也為今后赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株的改良和發(fā)酵效率的提高奠定了理論基礎(chǔ)。

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