郭穎，涂順明，駱練，劉新征，鄭芳燕

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

目前市場(chǎng)上常見的益生菌酸乳是以牛乳為原料的酸牛乳，而以大豆為原料的益生菌發(fā)酵酸豆乳產(chǎn)品比較罕見。這主要是因?yàn)橐嫔诙谷橹胁灰咨L(zhǎng)，豆乳中缺乏益生菌所能利用的乳糖，發(fā)酵后的產(chǎn)品酸度和菌數(shù)明顯低于酸牛乳，另一重要原因是豆乳發(fā)酵后會(huì)產(chǎn)生一些不良風(fēng)味和豆腥味，影響消費(fèi)者的接受度［1］。本研究通過優(yōu)化適合豆乳發(fā)酵的益生菌菌種和合理的工藝，較好地解決了上述問題。

益生菌酸豆乳通常是指大豆萃取液(豆乳)經(jīng)益生菌發(fā)酵制成的一種外觀頗似酸奶、具有獨(dú)特豆香味的健康食品。本研究采用動(dòng)/植物來源的菌種結(jié)合對(duì)豆乳進(jìn)行發(fā)酵研究，其中優(yōu)選的植物乳桿菌廣泛存在于泡菜中，是一種安全無害的有益菌種。由于大豆和泡菜均屬于植物性原料，因此具有一定的發(fā)酵相似性。實(shí)驗(yàn)證明，植物乳桿菌對(duì)豆乳發(fā)酵有其特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)［2］。將馴化后的動(dòng)物性來源的菌種(嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌)和植物性來源的菌種(植物乳桿菌)進(jìn)行混種發(fā)酵，并確定酸豆乳生產(chǎn)過程中的適宜發(fā)酵條件，開發(fā)出高品質(zhì)的益生菌發(fā)酵酸豆乳產(chǎn)品，可為優(yōu)質(zhì)大豆酸乳產(chǎn)業(yè)化提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆、全脂乳粉、蔗糖，市售。

1.2 菌種

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus，St)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus，Lb)、植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum，Lp)，均由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院植物蛋白研究中心提供。

1.3 培養(yǎng)基

脫脂乳培養(yǎng)基［3］:配制12%的全脂復(fù)原乳，100℃，30 min煮沸，自然冷卻。待出現(xiàn)脂肪層后，取下層乳液分裝于試管1/3處，121℃，15 min滅菌，冷卻，低溫保藏。用于工作發(fā)酵劑的制備。

MC培養(yǎng)基:按 GB 4789.35—2010附錄 A方法配制。用于嗜熱鏈球菌的活化、母發(fā)酵劑的制備和平板計(jì)數(shù)。

MRS培養(yǎng)基:按 GB 4789.35—2010附錄 A方法配制。用于保加利亞乳桿菌的活化、母發(fā)酵劑的制備和平板計(jì)數(shù)，以及乳酸菌菌落總數(shù)的平板計(jì)數(shù)。

CM0006 MRS培養(yǎng)基:酪蛋白胨 10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉 4.0 g，葡萄糖 20.0 g，MgSO40.2 g，乙酸鈉 5.0 g，檸檬酸三銨 2.0 g，K2HPO42.0 g，MnSO20.05 g，吐溫 80 1.0 g，蒸餾水 1 000 mL。pH(6.2 ±0.2)。固體培養(yǎng)基可添加 CaCO320.0 g，瓊脂 15.0 g。用于植物乳桿菌的活化、母發(fā)酵劑的制備和平板計(jì)數(shù)。

1.4 儀器與設(shè)備

HDL潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器公司;LDZX-30FB壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;SPX-150BⅢ生化培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器公司;PHS-3C型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠;NDJ-8S數(shù)字式黏度計(jì)，上海尼潤智能科技有限公司;九陽豆?jié){機(jī)，JYDZ，濟(jì)南九陽電器有限公司。

1.5 工藝流程和簡(jiǎn)要說明

大豆經(jīng)清洗后按豆水質(zhì)量比1∶6磨漿，100目過濾，得到蛋白質(zhì)含量為3%左右的豆乳，再經(jīng)配料和均質(zhì)，121℃，15 min滅菌，冷卻接種，按設(shè)定溫度發(fā)酵，4℃冷藏，12 h后制得益生菌酸豆乳。

1.6 方法

1.6.1 發(fā)酵用菌種的活化

將St、Lb和Lp分別接種于 MC、MRS和 CM0006 MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，活化2～3代備用。

1.6.2 母發(fā)酵劑和工作發(fā)酵劑的制備

將充分活化后的St、Lb和Lp于固體斜面培養(yǎng)基上分別轉(zhuǎn)接于MC、MRS和CM0006 MRS液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)48 h，制作成母發(fā)酵劑。

將母發(fā)酵劑按照3%的接種量接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，3種菌分別于43、43、37℃恒溫培養(yǎng)48 h，制作成工作發(fā)酵劑。

1.6.3 發(fā)酵用菌種的馴化

豆乳與牛乳成分上的主要區(qū)別在于豆乳中不含乳糖，致使益生菌在豆乳中不能很好地生長(zhǎng)繁殖。將St、Lb和Lp工作發(fā)酵劑按5%的接種量分別接種于12%的全脂復(fù)原乳(蛋白質(zhì)3%)中，在43、43、37℃的條件下恒溫培養(yǎng)，待培養(yǎng)液凝固后再傳至下一代。在此過程中，逐步用3%蛋白含量的豆乳代替牛乳，并逐漸增加豆乳量，如此繼代培養(yǎng)，直至益生菌可以適應(yīng)100%純豆乳的生長(zhǎng)環(huán)境［4］。

1.6.4 優(yōu)化酸豆乳發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.4.1 St、Lb 和 Lp 混種發(fā)酵菌種配比對(duì)發(fā)酵豆乳的影響

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了St和Lb的比例為1∶1為宜，因此，如何將Lp按照適當(dāng)?shù)谋壤c另外兩種菌混合發(fā)酵是本次試驗(yàn)的重點(diǎn)。

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分裝滅菌后冷卻到40℃，將St、Lb和Lp按照4∶4∶1、2∶2∶1、1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶4的比例接種，接種量為5%，40℃恒溫發(fā)酵5 h，之后4℃冷藏，后熟12 h，測(cè)定酸度。

1.6.4.2 接種量對(duì)發(fā)酵豆乳的影響

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分裝滅菌后冷卻到40℃，將St、Lb和Lp按照1∶1∶1的比例接種，接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%，40℃恒溫發(fā)酵5 h，之后4℃冷藏，后熟12 h，測(cè)定酸度。

1.6.4.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵豆乳的影響

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分裝滅菌后分別冷卻到31、34、37、40和43℃，將 St、Lb和Lp按照1∶1∶1的比例接種，接種量為5%，按以上溫度恒溫發(fā)酵5 h，之后4℃冷藏，后熟12 h，測(cè)定酸度。

1.6.4.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆乳的影響

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分裝滅菌后分別冷卻到40℃，將St、Lb和Lp按照1∶1∶1的比例接種，接種量為5%，40℃恒溫發(fā)酵3、4、5、6、7、8 h，之后 4 ℃冷藏，后熟 12 h，測(cè)定酸度。

1.7 指標(biāo)測(cè)定

酸度:采用GB 5413.34-2010方法;黏度:采用NDJ-8S數(shù)字式黏度計(jì);菌落總數(shù):采用GB 4789.35—2010方法。

1.8 感官評(píng)價(jià)

對(duì)于感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將豆腥味和乳清析出作為研究重點(diǎn)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 豆腥味和乳清析出情況評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards of beany flavor and whey separation evaluation for fermented soybean milk

1.9 優(yōu)化酸豆乳發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酸豆乳的酸度為指標(biāo)，以菌種配比(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)4個(gè)影響因素，設(shè)計(jì)L9(34)的正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵條件，因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels table of the orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的馴化結(jié)果

通過多次馴化后，得到圖1的結(jié)果。由圖1可以看出，隨著豆乳含量的增加，St在培養(yǎng)液中酸度呈先增加后減少的趨勢(shì)，酸度在豆乳含量為80%時(shí)達(dá)到最高;Lb在培養(yǎng)液中，酸度呈逐漸減少的趨勢(shì)，酸度在豆乳含量為0%時(shí)為最高;Lp在培養(yǎng)液中，其酸度從含20%豆乳時(shí)開始呈先升高后下降的趨勢(shì)，酸度在豆乳含量為80%時(shí)達(dá)到最高。在100%純豆乳中，St和Lp的生長(zhǎng)情況良好，酸度都能達(dá)到70.0°T以上(酸牛乳標(biāo)準(zhǔn)值)，但St酸度略低，而Lp酸度最高。

圖1 St、Lb與Lp在馴化過程中不同發(fā)酵樣品酸度的變化Fig.1 Acidity changes of different samples fermented by St，Lb and Lb during domesticating

由表3可以看出，馴化前3種菌在純豆乳中的生長(zhǎng)情況均不好，發(fā)酵終產(chǎn)品的菌數(shù)均偏低，未達(dá)到發(fā)酵乳國標(biāo)中對(duì)菌數(shù)的要求(≥1×106CFU/mL)。馴化后，3種菌最終發(fā)酵產(chǎn)品的菌數(shù)均有所提高，尤其是St和Lp發(fā)酵產(chǎn)品，達(dá)到了國標(biāo)要求，雖然Lb的發(fā)酵產(chǎn)品菌數(shù)仍未達(dá)標(biāo)，但與馴化前相比，增加了一個(gè)數(shù)量級(jí)，說明馴化結(jié)果基本符合要求。

從馴化后的感官效果看:St發(fā)酵產(chǎn)品凝乳時(shí)間短，凝固效果好，基本無乳清析出，但有豆腥味，且組織較粗糙;Lb發(fā)酵產(chǎn)品凝乳時(shí)間較長(zhǎng)，凝固效果較好，組織細(xì)膩，豆腥味極輕，有豆香味，但乳清析出較嚴(yán)重。Lp發(fā)酵產(chǎn)品凝乳時(shí)間短，凝固效果好，基本無乳清析出，醇香，無豆腥味，但有顆粒物感，不夠細(xì)膩。為了獲得更優(yōu)質(zhì)的酸豆乳產(chǎn)品，需綜合馴化后的三種菌的優(yōu)勢(shì)，對(duì)其進(jìn)行混種發(fā)酵研究和確定最佳工藝條件。

表3 St、Lb與Lp在馴化前后發(fā)酵豆乳的結(jié)果比較Table 3 Comparison of results of different samples fermented by St，Lb and Lb before and after domestication

2.2 St、Lb和Lp混種發(fā)酵菌種配比對(duì)發(fā)酵豆乳的影響

從圖2和表4結(jié)果看，隨著St和Lb的增加，產(chǎn)品的酸度逐漸降低，有部分乳清析出，以及輕微豆腥味;當(dāng)提高Lp的量時(shí)，產(chǎn)品的酸度逐漸增加(幅度不大)，終產(chǎn)品伴有淡豆香味，幾乎無豆腥味，但Lp量的增加產(chǎn)品會(huì)有顆粒物感，組織不夠細(xì)膩。因此，綜合上述結(jié)果，St、Lb 和 Lp 最佳配比為 1∶1∶1。

圖2 St、Lb與Lp混種發(fā)酵菌種配比對(duì)發(fā)酵豆乳酸度的影響Fig.2 Effect of ratio of strains on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

表4 St、Lb與Lp在不同配比下制得的發(fā)酵豆乳的感官評(píng)價(jià)Table 4 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different ratios

2.3 接種量對(duì)發(fā)酵豆乳的影響

圖3 St、Lb與Lp混種發(fā)酵接種量對(duì)發(fā)酵豆乳酸度的影響Fig.3 Effect of inoculum amount on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

從圖3可知，產(chǎn)品的酸度隨著接種量的增加而增加，當(dāng)接種量為5%時(shí)酸度達(dá)到最高值，隨后變化不大。從表5中感官指標(biāo)看，接種量5%時(shí)，產(chǎn)品無乳清析出，組織狀態(tài)細(xì)膩潤滑，有淡豆香味，無豆腥味。因此，確定最適接種量為5%。

表5 St、Lb與Lp在不同接種量下制得的發(fā)酵豆乳的感官評(píng)價(jià)Table 5 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different inoculum amounts

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵豆乳的影響

從圖4和表6結(jié)果可知，隨著發(fā)酵溫度的提高，產(chǎn)品的酸度逐漸升高，乳清析出逐漸減少，豆腥味逐漸減輕，豆香味逐漸增加，40℃時(shí)呈現(xiàn)了最佳值，但當(dāng)發(fā)酵溫度為43℃時(shí)，酸度明顯下降，豆腥味亦有所增加。因此，確定最適發(fā)酵溫度為40℃。

圖4 St、Lb與Lp混種發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵豆乳酸度的影響Fig.4 Effect of temperature on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

表6 St、Lb與Lp在不同溫度下制得的發(fā)酵豆乳的感官評(píng)價(jià)Table 6 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different temperatures

2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆乳的影響

從圖5看，發(fā)酵前段隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，產(chǎn)品酸度逐漸提高，發(fā)酵時(shí)間5～7 h時(shí)，酸度達(dá)到最高值并基本保持穩(wěn)定，7 h后酸度有所下降。從表7感官結(jié)果看，發(fā)酵5 h時(shí)，產(chǎn)品沒有豆腥味，亦無乳清析出，感官狀態(tài)好。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為5 h。

圖5 St、Lb與Lp混種發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆乳酸度的影響Fig.5 Effect of time on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

表7 St、Lb與Lp在不同時(shí)間下制得的發(fā)酵豆乳的感官評(píng)價(jià)Table 7 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different times

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

由于酸度是衡量酸乳中益生菌發(fā)酵優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)［5］，因此，在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酸度值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表8。

表8 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表Table 8 Analysis of results table of the orthogonal test

由表8可知，發(fā)酵溫度對(duì)酸度的影響最為顯著，各因素對(duì)酸度影響的主次順序?yàn)?發(fā)酵溫度C＞發(fā)酵時(shí)間 D＞接種量 B＞菌種配比 A，最優(yōu)條件為A2B2C2D2，即菌種配比 1∶1∶1，接種量 5%，發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時(shí)間5 h。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最優(yōu)發(fā)酵條件，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到的發(fā)酵酸豆乳的酸度為98.7°T，高于表中各項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)了正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的可靠性。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，開發(fā)的發(fā)酵酸豆乳測(cè)定結(jié)果是:酸度 98.7 °T，黏度 3 875 mPa·s，菌數(shù)達(dá)到5.63×108CFU/g，而且產(chǎn)品凝乳效果好，無乳清析出，無豆腥味，口感細(xì)膩潤滑，呈乳白色。

3 結(jié)論

(1)通過對(duì)所使用的3種菌種分別進(jìn)行馴化，使其最終均能適應(yīng)100%純豆乳的生長(zhǎng)環(huán)境。若將3種菌進(jìn)行混種發(fā)酵，可相互取長(zhǎng)補(bǔ)短，發(fā)揮更大的效果，為開發(fā)優(yōu)質(zhì)大豆酸乳奠定了良好的基礎(chǔ)。

(2)通過單因素和正交試驗(yàn)，確定了利用嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵100%純豆乳的最佳工藝條件是:菌株配比1∶1∶1、接種量5%、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時(shí)間5 h。在此優(yōu)化條件下，開發(fā)的發(fā)酵酸豆乳產(chǎn)品在酸度和益生菌菌數(shù)方面均達(dá)到了酸乳國標(biāo)要求，而且產(chǎn)品無豆腥味，口感風(fēng)味和感官狀態(tài)好，可為優(yōu)質(zhì)大豆酸乳加工提供技術(shù)參考。

［1］ 代養(yǎng)勇，曹健，董海洲，等.大豆食品豆腥味研究進(jìn)展［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2007，22(4):50-53.

［2］ 曲冬梅，劉小杰.植物乳桿菌及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.中國食品添加劑，2008(增刊1):219-222.

［3］ 劉景春，楊桂玲，張嶺.雙歧桿菌新型保健酸豆奶的生產(chǎn)工藝［J］.大豆通報(bào)，2002(4):24-25.

［4］ Naveed Ahmad，Li Li，Yang Xiaoquan，et al.Survivability and growth effects of three Lactobacillus cultures on texture and flavor aspects of soymilk［J］.Modern Food Science and Technology，2008，24(4):301-308.

［5］ 張麗萍，楊晨，王成強(qiáng)，等.干酪乳桿菌在酸奶生產(chǎn)中的應(yīng)用研究［J］.中國乳品工業(yè)，2007，35(2):23-26.