程磊，宗朕，陳卓靜，王磊，汪超，祁勇剛，柳志杰

(湖北工業(yè)大學工業(yè)發(fā)酵湖北省協同創(chuàng)新中心，武漢 430068)

赤蘚糖醇是一種四碳糖醇，具有熱量低，人體耐受性高，防齲齒，不引起血糖變化，改善膚質等優(yōu)點，可以作為甜味劑添加到食品和日化消費品中[1,2]。赤蘚糖醇同時還具有儲熱密度大、無腐蝕性、熱穩(wěn)定性好的理化性質，可用于制備優(yōu)良的相變材料[3]。赤蘚糖醇因其廣闊的應用前景，逐漸被重視。目前主要通過化學法、微生物發(fā)酵法生產赤蘚糖醇?；瘜W法是將淀粉用高碘酸法生成雙醛淀粉，在高溫高壓條件下，鎳作為催化劑，雙醛淀粉經氫化裂解成赤蘚糖醇及其他衍生物[4]。另外，祁廣賓等以葡萄糖鈉為原料氧化、加氫制備赤蘚糖醇[5]。但化學法存在流程長、成本高、產物選擇性低、安全性差等諸多問題，而微生物發(fā)酵法具有反應溫和、成本低廉、生產效率高等優(yōu)點，因而更加廣泛應用于赤蘚糖醇的工業(yè)化生產，其中主要使用的菌種是耐高滲透酵母，包括Pichia(畢赤氏酵母屬)，Candida(假絲酵母)，Torulopsis(球擬酵母屬)，Trigonopsis(三角酵母屬)，Moniliella(叢梗孢酵母屬)，Trichospornides(絲孢酵母屬)，Yarrowia(耶氏酵母屬)，Hansenula(漢森(氏)酵母屬)等[6]。本文主要從菌種選育、赤蘚糖醇的合成途徑、基因工程和發(fā)酵工藝四個方面闡述酵母菌生產赤蘚糖醇的研究進展，為提升酵母菌生產赤蘚糖醇的能力提供了參考，進而推動了微生物發(fā)酵生產赤蘚糖醇產業(yè)的發(fā)展。

1 赤蘚糖醇特性

赤蘚糖醇的化學名是1，2，3，4-丁四醇，分子式為C4H10O4，白色無味晶體，赤蘚糖醇吸濕性低，結晶性好，易粉碎制得粉狀產品，其吸濕性在糖醇及蔗糖等甜味劑中是最小的。赤蘚糖醇的熔點為118～122 ℃，沸點為329～331 ℃，熱穩(wěn)定性高，即使在160 ℃高溫環(huán)境中也不發(fā)生分解及變色，避免了食品在高溫加工過程中出現焦化，并且在pH 2～12的條件下穩(wěn)定，符合一般食品對酸堿的要求。因為赤蘚糖醇化學結構中無羰基，所以在與氨基酸共存的條件下不發(fā)生美拉德反應。其甜度約為蔗糖的75%，甜味純正，后味消失快，與其他甜味劑復配使用，如乙酰碘氨酸鉀、天冬酰苯氨酸甲酯等，能改善、協調味質的作用[7]。赤蘚糖醇實際為人體提供的熱量值在諸多糖醇類甜味劑中是最低的，被人體吸收后的赤蘚糖醇分子不能被機體內的酶系統分解，不為機體提供熱量，不參與糖代謝引起血糖變化，只能透過腎臟從血液濾出，隨尿液從人體排出。赤蘚糖醇的生物耐受性高，安全無毒，無致畸、致癌、誘導染色體變異等副作用[8]。赤蘚糖醇不能被口腔中的變異鏈球菌等細菌發(fā)酵利用，不會導致口腔中pH的變化，不會產生牙菌斑，而且赤蘚糖醇能抑制口腔鏈球菌的生長和生物膜的形成,因而赤蘚糖醇可以降低齲齒風險[9]。

2 生產赤蘚糖醇的酵母菌選育

酵母菌與霉菌、細菌相比，其安全性、赤蘚糖醇生產能力和產物選擇性占有明顯優(yōu)勢，因而酵母菌是比較適合生產赤蘚糖醇的菌種，工業(yè)上生產赤蘚糖醇的菌種大部分是酵母菌。產赤蘚糖醇的野生型酵母主要是從土壤、花粉、蜂蜜、蜂巢和發(fā)酵食品中分離獲得，然后對野生型菌種篩選、純化、誘變育種獲得高產赤蘚糖醇的酵母菌。1950年，Binkley等首次發(fā)現酵母菌生產赤蘚糖醇[10]。1956年，Spencer 等在研究耐高滲酵母產甘油時，發(fā)現酵母菌的培養(yǎng)條件與生長速度的改變，可生產赤蘚糖醇[11]。1964年，Hajny等從新鮮花粉中分離出1株圓酵母(Torulasp.) ，赤蘚糖醇轉化率可達到 35%～40%。1998年，Park 等從蜂巢中分離得到的耐高滲酵母(Trichosporonsp.)，赤蘚糖醇產量可達到209 g/L[12，13]。2001年，Shie-Jea Lin等從花粉和蜂蜜中分離出6株產赤蘚糖醇的耐高滲透酵母，其生產赤蘚糖醇的轉化率達37%。2010年，Shie-Jea Lin等又從蜂蜜中分離出1株高產赤蘚糖醇的叢梗孢酵母(Moniliellasp.)，但該菌種對赤蘚糖醇有較強的吸收能力[14]。然后該課題組采用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)誘變后篩選得到N61188-12,該菌株對赤蘚糖醇的吸收較弱，在2000 L的發(fā)酵罐中經過10天發(fā)酵，赤蘚糖醇產量達189.4 g/L[15]。2008年，Waldemar Rymowicz等篩選的突變型Y.lipolyticaWratislavia K1,赤蘚糖醇的產量達170 g/L,轉化率為56%。2014年，Waldemar Rymowicz等進一步采用紫外線誘變Wratislavia K1，得到突變型菌株MK1，其赤蘚糖醇的最高產量為224 g/L,轉化率為77%，而所得到的副產物總量低于2.3%[16]。2016年，Liu Xiaoyan等通過常壓室溫等離子體突變系統誘變野生型Y.lipolyticaSWJ-1b,隨后從該株菌的突變菌株中篩選出了菌種M53，生產赤蘚糖醇的轉化率達64.8%[17]，而且菌種M53能夠將廢棄的食用油作為碳源生產赤蘚糖醇，降低了生產成本[18]。

國內對于產赤蘚糖醇菌種的研究較晚，徐虹等、范光先等、吳燕等、葉嫻等、王鳳偉等從不同材料中分離得到的產赤蘚糖醇的酵母菌，但赤蘚糖醇的產量和轉化率均偏低[19-23]。

3 赤蘚糖醇的合成途徑

酵母菌能夠分別利用葡萄糖和甘油合成赤蘚糖醇，其中葡萄糖主要來源于淀粉質原料的酶解，獲取成本較高。甘油可作為副產物從生物燃料生產過程中獲取，成本低廉，而且所具備的高滲透壓特性能增強酵母菌生產赤蘚糖醇的能力[24],酵母菌以甘油為基質生產赤蘚糖醇的代謝途徑復雜，其中涉及的酶和中間產物較多，此代謝途徑有更大的研究潛力。以下分別介紹酵母菌以葡萄糖和甘油為基質生產赤蘚糖醇的代謝途徑。

酵母菌生產赤蘚糖醇的主要途徑是在需氧條件下，通過磷酸戊糖途徑生產赤蘚糖醇，見圖1。

圖1 酵母菌利用葡萄糖生產赤蘚糖醇

葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后在轉酮酶的催化下轉化為4-磷酸赤蘚糖，進一步在4-磷酸赤蘚糖激酶的去磷酸化作用下生成赤蘚糖醇，最后在赤蘚糖還原酶催化加氫作用下生成赤蘚糖醇[25]。

酵母菌通過磷酸化途徑利用甘油生產赤蘚糖醇[26]。在發(fā)酵底物中，作為碳源的甘油被甘油激酶磷轉化為甘油-3-磷酸，進一步脫氫形成二羥丙酮磷酸,然后在異構酶和轉酮醇酶的作用下轉化為赤蘚糖-4-磷酸和其他代謝產物，經過磷酸戊糖途徑，脫磷酸生成赤蘚糖，最終在赤蘚糖還原酶的作用下脫氫形成赤蘚糖醇，見圖2。

圖2 酵母菌利用甘油生產赤蘚糖醇

在該代謝途徑中，轉酮醇酶是關鍵性的酶，對赤蘚糖-4-磷酸的代謝量有顯著的影響，進而影響赤蘚糖醇的最終產量[27]。

4 基因工程改造酵母菌

酵母菌在利用甘油合成赤蘚糖醇的途徑中存在許多關鍵性的酶，如轉酮酶、轉醛醇和赤蘚糖醇還原酶等，對酵母菌的赤蘚糖醇產量有極大的影響[28]。采用基因工程的方法對產赤蘚糖醇的酵母基因序列的修飾，影響相關酶的基因表達量，最終可以實現增加赤蘚糖醇的生產量和轉化率的目的。近年來，研究者還發(fā)現了酵母菌以赤蘚糖醇作為碳源表達的關鍵基因，敲除該基因進一步增加了酵母菌的赤蘚糖醇最終產量[29,30]。

Dorota A Rzechonek等發(fā)現突變型Y.lipolyticaWratislavia K1無法分解利用赤蘚糖醇，但是Wratislavia K1的突變型菌株MK1能在赤蘚糖醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。采用反轉錄PCR分析MK1，顯示突變型菌株MK1中基因EUF1(YALI0F01562g)表達量顯著增加。進一步敲除了菌株AMM(由MK1衍生)中基因序列EUF1，發(fā)現菌株AMM無法在赤蘚糖醇為碳源的培養(yǎng)基中生長，確定了EUF1是酵母菌利用赤蘚糖醇的關鍵基因序列。Carly F等在研究中證實了酵母中的基因EYK1(YALI0F01606g)是酵母菌分解利用赤蘚糖醇的關鍵基因，該基因表達赤蘚酮糖激酶。Tomasz Janek等超量表達酵母菌中編碼赤蘚糖還原酶的基因(YALI0F18590g)，赤蘚糖醇的最終產量比對照組高20%[31]。Aleksandra M等構建了工程菌AJD pADUGut1/2，同時超量表達基因GUT1(表達甘油激酶)和GUT2(表達甘油-3-磷酸脫氫酶)，增加了赤蘚糖醇代謝途徑中的中間體，該株菌的赤蘚糖醇產量比對照組增加了35%[32]。Frédéric Carly等重新構建的菌株FCY214，超量表達基因GUT1(表達甘油激酶)、TKL1(表達轉酮醇酶)，比母本菌株的生產速率提升了75%，然后敲除了FCY214中基因EYK(表達赤蘚酮糖激酶)，使該菌種無法利用赤蘚糖醇作為碳源[33]。

5 發(fā)酵工藝

優(yōu)質菌種是生產目的產物的重要因素，優(yōu)良的發(fā)酵工藝則能進一步提升發(fā)酵產物的產量和生產效率。近年來，研究者們對赤蘚糖醇發(fā)酵工藝的研究主要集中于培養(yǎng)基組分和滲透壓。

5.1 培養(yǎng)基組分

Ludwika Tomaszewska等研究了酵母提取物、胰蛋白胨、(NH4)SO4、玉米漿等作為氮源和維生素來源對Y.lipolyticaWratislavia K1生產赤蘚糖醇過程的影響，發(fā)現酵母提取物是Wratislavia K1的最佳氮源和維生素來源。Wratislavia K1在325 kg/m3的高濃度底物分批發(fā)酵168 h后，赤蘚糖醇的產量達325 kg/m3，并且在消耗了部分甘油后添加酵母提取物，副產物明顯減少，其總量沒有超過10%[34]。Rywinska,Anita等采用響應面分析法優(yōu)化了菌種Wratislavia K1的培養(yǎng)基組分，(NH4)SO4,KH2SO4,NaCl添加量分別為2.25,0.22,26.4 g/L，碳氮比例為81∶1。菌株Wratislavia K1在添加了100 g/L甘油的該培養(yǎng)基中，赤蘚糖醇的生產量為46.9 g/L，轉化率為47%[35]。Magdalena Rakicka等研究的結果顯示Y.lipolyticaMK1以甘為碳源的培養(yǎng)基中最適碳氮比例是80∶1，在該條件下，菌種MK1生產赤蘚糖醇的最高產量為113.1 g/L，轉化率為58%[36]。

此外，在培養(yǎng)基中添加輔助物質能提升酵母菌生產赤蘚糖醇的能力。過高的滲透壓會抑制酵母生長，甚至使發(fā)酵過程停滯，降低赤蘚糖醇的生產率[37]。楊利博等向培養(yǎng)基中添加甘氨酸、脯氨酸協助酵母菌抵抗高滲透壓，顯著減輕了高滲透壓對酵母菌生長的抑制效果，提升了赤蘚糖醇的生產能力[38]。Ludwika Tomaszewska首次研究了銅、鐵、錳、鋅離子對Y.lipolytica生產赤蘚糖醇能力的影響，其中錳離子促進作用最顯著，菌株Wratislavia K1在添加了錳離子的培養(yǎng)基中赤蘚糖醇的生產量比對照組提升了14.5%，赤蘚糖還原酶活力提升至對照組的1.3倍[39]。表面活性劑能提升細胞膜通透性，進而提升菌種代謝產物的生產量，Magdalena Rakicka等對比了3種表面活性劑Triton X-100,Span 20和Tween 80對菌株Wratislavia K1生產赤蘚糖醇的影響，結果顯示Span 20組的赤蘚糖醇產量比對照組提升了15%[40]。

5.2 滲透壓

高滲透壓環(huán)境有利于酵母菌合成赤蘚糖醇,但是其中的機理及滲透壓的控制模式尚處于研究階段。Yang Li-bo等在Y.lipolytica分批補料式發(fā)酵生產赤蘚糖醇中，首次采用了1種NaCl控制兩階段滲透壓的策略。第一階段(0～96 h)維持滲透壓處于4.25 osmol/kg的較低水平以減少對菌體生長的抑制，第二階段(132～196 h)控制滲透壓至4.94 osmol/kg使赤蘚糖醇的生產速率保持高水平，赤蘚糖醇的最高產量和生產速率比第一階段分批補料發(fā)酵提升了25.7%，2.2%，達到了194.3，0.95 g/L/h。Ludwika Tomaszewska-Hetman等進一步研究了高滲透壓Y.lipolytica的影響，菌株A-3以甘油為基質，置于75 g/dm3NaCl的高滲透壓環(huán)境中，甘油激酶和甘油-3-磷酸脫氫酶的活力分別下降了78%，25%，而轉酮醇酶和赤蘚糖還原酶的活力沒有變化。Yang Li-bo 等通過分析Y.lipolytica在高滲透壓環(huán)境中，與能量、新陳代謝、細胞修復、應激反應等相關的54種蛋白質，該課題組發(fā)現Y.lipolytica在高滲透壓環(huán)境中能提升赤蘚糖醇的生產能力主要是因為高滲透壓引起轉酮醇酶、磷酸丙糖異構酶和滲透壓應激蛋白類的表達顯著增強[41]。

6 展望

目前研究者已經通過自然選育和誘變育種篩選出具備高產量和高產率的優(yōu)良酵母菌菌種，并且優(yōu)化了發(fā)酵工藝，進一步提高了赤蘚糖醇的產量。但是高滲透壓對酵母菌合成赤蘚糖醇影響機理的研究依然停留在相關蛋白質水平,后續(xù)可以結合基因工程和代謝組學深入研究，鑒定其中涉及的酶及基因，對酵母菌合成赤蘚糖醇的代謝途徑進行更加精準的調控，提高赤蘚糖醇的產量。