曾偉主，單小玉，房峻，周景文*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學 未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122)

2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)是生產(chǎn)維生素C的直接前體[1]。維生素C是人體維持正常生命活動必需的維生素，是一種有效的抗氧化劑，廣泛應用于化妝品、食品、飲料、制藥和飼料等領(lǐng)域[2-4]。我國是維生素C生產(chǎn)大國，產(chǎn)能占世界90%以上，生產(chǎn)技術(shù)水平和生產(chǎn)規(guī)模均達到世界領(lǐng)先水平[5]。維生素C生產(chǎn)通常先利用微生物發(fā)酵合成2-KLG，再將2-KLG酯化生成維生素C。目前，維生素C生產(chǎn)主要依賴由氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)和普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonicigeniumvulgare)組成的三菌二步發(fā)酵法[6-7]。隨著發(fā)酵工業(yè)的不斷發(fā)展，三菌二步發(fā)酵法存在的缺陷日益凸顯，如菌株選育困難、操作復雜且穩(wěn)定性差、原材料與能源消耗大等，不僅導致生產(chǎn)成本顯著高于類似產(chǎn)品，菌株選育也一直未能取得重要突破[8-9]。

研究人員企圖通過構(gòu)建一菌一步發(fā)酵法從根源上解決三菌二步發(fā)酵法中存在的問題。ANDERSONT等試圖通過在歐文氏菌(Erwiniaherbicola)過量表達來源于谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸還原酶，以葡萄糖為底物生產(chǎn)2,5-二酮基-D-葡萄糖酸，然后再生產(chǎn)2-KLG，但由于酶活力較低以及輔因子再生不匹配等問題，該方法始終未能實現(xiàn)2-KLG的高效生產(chǎn)[10]。SAITO等將來源于G.oxydansT100中合成2-KLG的2個關(guān)鍵脫氫酶山梨糖脫氫酶(sorbose dehydrogenase，SDH)和山梨酮脫氫酶(sorbosone dehydrogenase，SNDH)在G.oxydans表達，可以實現(xiàn)2-KLG的少量積累，但在大腸桿菌中進行過表達，卻不能實現(xiàn)2-KLG的積累，經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，SDH低酶活力是其主要的限制因素[11]。本研究室前期在G.oxydansWSH-003中表達山梨糖/山梨酮脫氫酶(SSDHs)，成功構(gòu)建了2-KLG一步發(fā)酵菌，但脫氫酶SSDHs的底物/產(chǎn)物特異性較差，2-KLG得率始終低于70%[12-13]。目前，一步一菌發(fā)酵法存在的問題主要包括輔因子再生、關(guān)鍵酶的鑒定以及中間代謝副產(chǎn)物的競爭等[14-15]。

本研究室通過建立基于2-KLG還原酶的高通量篩選方法，篩選到1株可直接積累2-KLG的G.oxydansWSH-004，該菌株含有依賴輔助因子FAD的SDH，可以轉(zhuǎn)化L-山梨糖直接生成2-KLG，轉(zhuǎn)化率幾乎100%，但由于酶活性較低，2-KLG積累量仍較低[16]。在EscherichiacoliBL21 (DE3)中組成型表達SDH，獲得了1株能積累2-KLG的菌株E.coliBL21(DE3)-pMD19-cspA-SDH，但該菌株能在低濃度L-山梨糖培養(yǎng)基中良好生長，在較高濃度L-山梨糖培養(yǎng)基中生長速度很慢，而菌種前期的生長狀態(tài)對目的產(chǎn)物的高效積累具有關(guān)鍵作用[17]。近年來，通過適應性進化策略顯著提高了工業(yè)微生物的底物耐受性以及生產(chǎn)性能[18-19]。張翀等開發(fā)了一種基于微流控技術(shù)的全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)(microbial microdroplet culture system，MMC)，能夠?qū)崟r在線檢測微生物的生長(OD)，定時定量更換新鮮培養(yǎng)基或添加化學因子，并完成微生物繼代培養(yǎng)，從而實現(xiàn)菌株的進化和篩選[20-21]?；诖?，本研究應用MMC對出發(fā)菌株進行不同濃度梯度L-山梨糖的適應性進化，提高出發(fā)菌株對L-山梨糖的耐受性，并考察其發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG的性能。結(jié)果表明進化菌株具有較好的積累2-KLG的能力，該研究為一菌一步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C前體2-KLG提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

EscherichiacoliBL21(DE3)-pMD19-cspA-SDH由本實驗室前期研究構(gòu)建[17]，氧化葡萄糖酸桿菌G.oxydansWSH-004 (保藏號：CCTCC M2019481)，由本研究室前期篩選獲得，用于擴增SNDH基因[16]。

1.1.2 主要試劑

蛋白胨和酵母粉，Oxoid公司；氨芐青霉素(Amp)、NaCl，上海國藥集團；各種用于構(gòu)建載體的一步克隆酶、連接酶以及商品化的pMD19-T Simple Vector，大連寶生物(TaKaRa)有限公司；L-山梨糖，本實驗室發(fā)酵提取獲得。

1.1.3 主要儀器

搖床，上海知楚儀器有限公司；島津液相色譜儀，日本shimadzu公司；Nanodrop ND-2000分光光度計，美國Thermo公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司；離心機，美國Eppendorf公司；全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)儀，無錫源清天木生物科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10，115 ℃，滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10，根據(jù)需要添加不同濃度的L-山梨糖，115 ℃，滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)

將出發(fā)菌株E.coliBL21(DE3)-pMD19-cspA-SDH通過MMC進行適應性進化培養(yǎng)。首先，在MMC上進行生長曲線測定，獲得該菌株培養(yǎng)至生長對數(shù)期的時間，選擇在對數(shù)中期開始進行下次傳代。根據(jù)前期生長曲線的測定設(shè)定傳代時間，在分別添加10.00、13.33、16.67和20.00 g/L四個不同低質(zhì)量濃度的L-山梨糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)進化，每個質(zhì)量濃度傳代2次。在此基礎(chǔ)上，在10.00、20.00和30.00 g/L三個中質(zhì)量濃度梯度的L-山梨糖培養(yǎng)基中進化，每個梯度傳代至少5次，第1輪進化結(jié)束后，獲得較好的進化菌株。繼續(xù)進行第2輪進化，將第1輪獲得的進化菌株培養(yǎng)到對數(shù)中期，依次按照含有30、50、70和100 g/L四個不同質(zhì)量濃度L-山梨糖培養(yǎng)基中進化，每個梯度傳代5次，獲得更好的耐受高L-山梨糖的菌株。

1.2.2 菌株構(gòu)建

參照文獻[17]設(shè)計引物。應用PCR技術(shù)將G.oxydansWSH-004來源的SNDH，應用一步克隆的方法獲得誘導型表達SNDH的質(zhì)粒(pET28a-SNDH)，轉(zhuǎn)入進化菌株2-F6。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 細胞培養(yǎng)的方法

種子培養(yǎng)：將保存在-80 ℃冰箱的菌株劃線，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，挑取平板上的單菌落轉(zhuǎn)接至14 mL搖菌管種子液，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)9～12 h。

1.2.4 進化菌株搖瓶生長狀況

在LB培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的L-山梨糖，配制不同底物質(zhì)量濃度L-山梨糖培養(yǎng)基(10、30、100和200 g/L)，25 mL分裝至250 mL搖瓶中。以體積分數(shù)2%的接種量接入培養(yǎng)好的種子液，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)2 h，調(diào)節(jié)溫度至30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，取不同時間點檢測OD600值。

1.2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

接種量分別選擇2%、4%、6%、8%、10%、12%和14% (體積分數(shù))，每個接種量做3個平行，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)2 h，調(diào)節(jié)溫度至30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵72 h后檢測2-KLG的積累量；在優(yōu)化接種量的基礎(chǔ)上進行發(fā)酵溫度的優(yōu)化，選擇了25、30和37 ℃三個溫度進行對比，發(fā)酵72 h后，檢測2-KLG的產(chǎn)量；在優(yōu)化了接種量和培養(yǎng)溫度的基礎(chǔ)上，對SNDH的IPTG誘導時間和誘導濃度進行優(yōu)化。本部分所用發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，L-山梨糖添加量為1%(體積分數(shù))。

1.2.6 發(fā)酵罐分批發(fā)酵

在5 L發(fā)酵罐中，裝液量為2.5 L，接種量為2%。接種前加入50 μg/mL卡納抗生素和100 μg/mL氨芐抗生素，通氣量1 vvm，轉(zhuǎn)速300 r/min。當OD600值為3～4時加入IPTG誘導，同時加入底物L-山梨糖。

1.2.7 液相檢測條件

采用高效液相色譜法檢測2-KLG含量。色譜柱：Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Hercules, CA)，檢測器：示差檢測器，檢測條件：流動相5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高濃度L-山梨糖菌株的進化

以E.coliBL21(DE3)-pMD19-cspA-SDH為出發(fā)菌株，在MMC上測定生長曲線，確定6 h時為傳代時間(圖1-a)。在6～48 h依次在添加10.00、13.33、16.67和20.00 g/L四個不同低質(zhì)量濃度的L-山梨糖培養(yǎng)基進化(圖1-b)，繼續(xù)在10.00、20.00和30.00 g/L三個中質(zhì)量濃度梯度L-山梨糖培養(yǎng)基中進化(圖1-c)。第1輪進化后獲得了1株較好的耐受菌1-18，比較耐受菌株1-18 (b)與出發(fā)菌株(a)的生長狀況，發(fā)現(xiàn)在30 g/L的L-山梨糖培養(yǎng)基中耐受菌株前期生長明顯快于出發(fā)菌株(圖1-d)。為了獲得耐受性更好的菌株，在含有30、50、70和100 g/L四個不同質(zhì)量濃度L-山梨糖培養(yǎng)基中進行第2輪進化(圖1-e)，最終獲得了1株能耐受更高L-山梨糖濃度的菌株2-F6。對比耐受菌株2-F6 (d)與出發(fā)菌株(c)生長狀況，發(fā)現(xiàn)在100 g/L的高濃度L-山梨糖培養(yǎng)基中，耐受菌株生長明顯快于出發(fā)菌株(圖1-f)。表明通過MMC的培養(yǎng)提高了菌株對L-山梨糖的耐受性，進化菌株在高濃度L-山梨糖培養(yǎng)基中能夠生長良好。

a-出發(fā)菌株生長曲線；b-較低質(zhì)量濃度L-山梨糖(梯度質(zhì)量濃度為10.00、13.33、16.67和20.00 g/L)培養(yǎng)基中的進化過程；c-中質(zhì)量濃度 L-山梨糖(梯度質(zhì)量濃度為10.00、20.00和30.00 g/L)培養(yǎng)基中的進化過程；d-出發(fā)菌株(a)和進化菌株1-18 (b)的生長對比；e-高質(zhì)量濃度 L-山梨糖(梯度質(zhì)量濃度為30.00、50.00、70.00和100.00 g/L)培養(yǎng)基中的進化過程；f-出發(fā)菌株(c)和進化菌株2-F6 (d)的生長對比圖1 菌株耐高濃度L-山梨糖的適應性進化結(jié)果Fig.1 Results of adaptive laboratory evolution of high concentration L-sorbose

2.2 進化菌株在搖瓶水平上的生長情況驗證

為了檢測在MMC上獲得的進化菌株能否在搖瓶中有著同樣良好的生長狀況，在搖瓶水平上考察了2株進化菌株的生長狀況，以出發(fā)菌株為對照。將3株菌株分別在1%、3%、10% 和20%四個不同濃度的L-山梨糖培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，結(jié)果如圖2-a所示。發(fā)現(xiàn)進化菌株的生長狀況與出發(fā)菌株存在明顯差異，在添加10 g/LL-山梨糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，進化菌株與出發(fā)菌株均可良好生長，而當培養(yǎng)基中L-山梨糖含量增加至30 g/L后，出發(fā)菌株出現(xiàn)了生長緩慢的現(xiàn)象，生長趨勢明顯遲于進化菌株，而進化菌株2-F6更優(yōu)于1-18。結(jié)果表明進化得到的高濃度L-山梨糖耐受菌，在添加高濃度L-山梨糖培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)也具有良好的生長能力，且在不同L-山梨糖培養(yǎng)基中均可較好地生長。

a-添加10 g/L L-山梨糖；b-添加30 g/L L-山梨糖；c-添加100 g/L L-山梨糖；d-添加200 g/L L-山梨糖圖2 進化菌株在搖瓶中的生長狀況Fig.2 Growth of evolutionary strains in shaking flasks

2.3 進化菌株積累2-KLG的發(fā)酵條件優(yōu)化

前期研究發(fā)現(xiàn)，在組成型表達了SDH的大腸桿菌工程菌中繼續(xù)表達關(guān)鍵酶山梨酮脫氫酶SNDH能提高2-KLG的產(chǎn)量?；谇捌跇?gòu)建的雙酶表達系統(tǒng)，在進化菌株2-F6中游離表達了SNDH提高菌株利用L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG的能力[17]。在搖瓶水平上，比較了不同接種量、發(fā)酵溫度以及對SNDH誘導時間和IPTG誘導濃度對進行菌株積累2-KLG的影響，結(jié)果如圖3所示。

a-接種量的影響；b-發(fā)酵溫度的影響；c-誘導時間的影響；d-IPTG濃度的影響圖3 搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of culture conditions in shaking flasks

當接種量在體積分數(shù)10%以內(nèi)時，2-KLG產(chǎn)量沒有明顯差異，而超過10%后，2-KLG產(chǎn)量有所下降(圖3-a)。培養(yǎng)溫度為30 ℃最佳，繼續(xù)升高溫度反而不利于2-KLG的積累(圖3-b)。培養(yǎng)3 h后誘導更有利于2-KLG的積累(3-c)。誘導劑IPTG的濃度對2-KLG產(chǎn)量的影響結(jié)果顯示，IPTG濃度為0.3 mmol/L時2-KLG產(chǎn)量最高(圖3-d)。

2.4 L-山梨糖添加量對進化菌株積累2-KLG的影響

上述實驗表明,經(jīng)MMC進化后的進化菌株在低濃度的L-山梨糖培養(yǎng)基中的生長明顯優(yōu)于出發(fā)菌株，考慮到進化菌株仍無法完全將培養(yǎng)基中添加的L-山梨糖轉(zhuǎn)化生成2-KLG。因此，在搖瓶水平上繼續(xù)考察添加10、20和30 g/L三個較低濃度L-山梨糖的培養(yǎng)基對共表達SDH/SNDH的進化菌株2-F6積累2-KLG的影響，以表達SDH的進化菌株2-F6為對照，結(jié)果如圖4所示。

a-只表達SDH的進化菌株2-F6；b-共表達SDH/SNDH的進化菌株圖4 不同L-山梨糖濃度對進化菌株積累2-KLG的影響Fig.4 Effects of different L-sorbose concentrations on 2-KLG accumulation in evolutionary strain

共表達SDH/SNDH的進化菌株(圖4-b)的發(fā)酵性能明顯優(yōu)于表達SDH的進化菌株(圖4-a)。共表達SDH/SNDH的進化菌株發(fā)酵24 h時，不同L-山梨糖添加量對產(chǎn)物的影響較為明顯；當發(fā)酵至48 h時，添加10、20和30 g/L三種不同質(zhì)量濃度的L-山梨糖培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)的2-KLG量分別為5.10、5.40和6.05 g/L，含有10 g/LL-山梨糖和20 g/LL-山梨糖的發(fā)酵液中2-KLG產(chǎn)量差異不明顯，含有30 g/LL-山梨糖的發(fā)酵液中2-KLG產(chǎn)量最高。結(jié)果表明菌株已具有耐受較高濃度L-山梨糖的能力，不同L-山梨糖濃度對2-KLG產(chǎn)量的影響不顯著。

2.5 進化菌株在5 L罐上發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG

在搖瓶上對重組進化菌株的生長以及2-KLG的產(chǎn)量進行了較全面的優(yōu)化，得到最佳接種量為體積分數(shù)2%，培養(yǎng)3 h后加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG進行誘導，底物L-山梨糖的添加量為30 g/L。為了解重組菌在發(fā)酵罐上的生長特性，在5 L發(fā)酵罐上參考搖瓶發(fā)酵條件上進行一次性發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程中菌體的濃度、pH、L-山梨糖消耗及2-KLG產(chǎn)量的變化如圖5所示。0～8 h菌體生長較快，8～12 h菌體生長較慢，32～36 h菌體出現(xiàn)二次生長，36 h后達到穩(wěn)定期。發(fā)酵前24 h內(nèi)底物被快速利用，產(chǎn)物2-KLG快速積累，24 h之后底物緩慢被消耗，底物生成量變化不大，2-KLG的最高產(chǎn)量為5.70 g/L。而過程中pH呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，由于2-KLG的積累變慢，pH降低至5～6之間后變化較少。取樣檢測發(fā)現(xiàn)，L-山梨糖初始質(zhì)量濃度為28.56 g/L，發(fā)酵結(jié)束后L-山梨糖仍剩余20.91 g/L，已利用部分的底物轉(zhuǎn)化率達74.5%。發(fā)酵后期發(fā)酵液中仍在大量底物剩余，后期研究可進一步優(yōu)化提高2-KLG的產(chǎn)量。

圖5 5 L罐發(fā)酵過程曲線Fig.5 Process curve in 5 L fermenter

3 結(jié)論

與維生素C生產(chǎn)相關(guān)的研究主要集中在其前體2-KLG，目前，2-KLG主要采用三菌二步發(fā)酵法生產(chǎn)。隨著新一代發(fā)酵工程技術(shù)的興起，三菌二步發(fā)酵法存在的菌株選育困難、操作復雜、穩(wěn)定性差和原材料與能源消耗大等問題缺陷日益顯著，建立高效的一菌一步法顯得日趨重要。近年來，雖然研究人員已開展大量工作，但一菌一步工程菌生產(chǎn)2-KLG的效率遠比經(jīng)典三菌兩步發(fā)酵法低，始終未達到工業(yè)生產(chǎn)的目標。因此，要實現(xiàn)一菌一步發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)仍面臨許多挑戰(zhàn)[24]。

本研究基于前期構(gòu)建的1株組成型表達山梨糖脫氫酶SDH轉(zhuǎn)化L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG，但不能耐受高濃度底物L-山梨糖的大腸桿菌工程菌為研究對象，應用全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)，篩選獲得了1株能耐受高濃度L-山梨糖的進化菌株2-F6。在進化菌株中共表達2-KLG合成的另一個關(guān)鍵酶山梨酮脫氫酶SNDH，并在搖瓶水平上對接種量、發(fā)酵溫度、SNDH誘導表達時間、誘導劑IPTG添加量以及初始山梨糖添加量等條件進行了優(yōu)化，之后進一步在5 L發(fā)酵罐中進行了放大培養(yǎng)。最終，在5 L發(fā)酵罐中2-KLG的產(chǎn)量達5.70 g/L，已利用部分的底物轉(zhuǎn)化率達74.5%，發(fā)酵液中剩余大量的底物。在后續(xù)研究中，我們將采取強化基因表達、提高關(guān)鍵酶活性、敲除或抑制副產(chǎn)物生成途徑以及發(fā)酵過程優(yōu)化等策略進一步提高2-KLG的產(chǎn)量和底物L-山梨糖的實際轉(zhuǎn)化率。