趙靜，祁巖，王月華，馮敘橋

1(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州，121013)

2(美國加州大學(xué)戴維斯分校環(huán)境毒理系，美國加州戴維斯市，95616)

3(美國伊利諾伊理工大學(xué)食品安全與健康學(xué)院，美國伊利諾伊州芝加哥市，60616)

4(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽，110866)

藻膽蛋白是藻類特有的捕光色素蛋白，主要可以分為藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻紅藍(lán)蛋白。藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，PC)是一種深藍(lán)色粉末，它既是蛋白質(zhì)又是良好的天然食用色素，多見于螺旋藻［1］、魚腥藻［2］、地木耳［3］中，其中螺旋藻細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量豐富，PC占總蛋白質(zhì)的7%左右［4］。

PC具有抗癌、抗氧化、治療腦缺血損傷、提高機(jī)體免疫力等多種生理功能，有關(guān)PC的研究已經(jīng)成為天然海洋藥物的研究熱點(diǎn)［5］。PC的提取分離技術(shù)也成為時下人們所關(guān)注的問題之一。本文對近年來涌現(xiàn)出的PC提取和分離技術(shù)以及影響其分離純化的因素加以整合，并進(jìn)行了論述。

1 PC的分離純化技術(shù)

傳統(tǒng)的PC分離提純技術(shù)一般通過超聲、反復(fù)凍融、酶解和高壓均質(zhì)等方法使細(xì)胞裂解獲得PC粗提液，之后將(NH4)2SO4沉淀法與多種色譜層析法結(jié)合使用［6］，從而達(dá)到分離純化的目的。此類方法存在步驟繁瑣、蛋白質(zhì)損失量較大、難以規(guī)?；茝V，且高于50%的生產(chǎn)成本用在純化的過程中［7］等缺點(diǎn)。為解決PC純度問題，近幾十年來出現(xiàn)了一系列分離純化PC的技術(shù)，其主要目標(biāo)是為了改善PC的品質(zhì)，它們的分離提純工藝大致相同，但卻在分離提純時間、成本、回收率、純度等方面各有所長。目前，PC常用的分離純化技術(shù)有鹽析、雙水相萃取、反膠團(tuán)萃取、柱層析等幾種，下面分別對每種方法的特點(diǎn)進(jìn)行介紹。

1.1 多步鹽析

鹽析(salting out)是現(xiàn)今蛋白質(zhì)分離純化中較常用的方法，主要通過向蛋白質(zhì)溶液中加入濃的無機(jī)鹽溶液［如(NH4)2SO4或Na2SO4溶液］，進(jìn)而使蛋白質(zhì)凝聚而析出。鹽析是一個可逆的過程，不會影響蛋白質(zhì)本身特有的性質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)分離技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員對鹽析方法有了新的改良，使之成為更適用于PC提純的方法。

王巍杰等［8］以鈍頂螺旋藻為材料，對多步鹽析分離純化進(jìn)行了研究。他們采用反復(fù)凍融的方法將藻體細(xì)胞破碎，并將獲得的PC粗體液依次進(jìn)行兩步鹽析、四步鹽析、六步鹽析和多步鹽析，進(jìn)而分析鹽析次數(shù)對PC回收率和純度的影響。兩步鹽析即將PC粗體液分別置于 15%、20%、25%、30%的 4個(NH4)2SO4飽和梯度組中，4℃靜置12 h后離心，取上清液，各組飽和度分別追加至45%、50%、55%、60%，在 4℃溫度下靜置 12 h，離心，沉淀用 PBS(0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH=7，含 0.002 mol/L EDTA，簡稱PBS)溶解后測其吸光度，計(jì)算兩步鹽析后PC回收率和純度。四步鹽析即將二步鹽析得到的粗體液分別置于 5%、10%、15% 的 3個(NH4)2SO4飽和梯度組中，4℃下靜置12 h，離心，取上清，各組飽和度分別追加至33%、35%、37%，4℃靜置12 h，離心，沉淀用PBS溶解后測其吸光度，計(jì)算四步鹽析后PC的回收率和純度。六步鹽析即將四步鹽析得到的粗體液分別置于20%、23%、25%、27% 的4個(NH4)2SO4飽和梯度組中，4℃靜置12 h，離心，取上清液，各組飽和度分別追加至30%、35%、40%、45%，4℃靜置12 h，離心，沉淀用PBS溶解后測其吸光度，計(jì)算六步鹽析后PC的回收率和純度。多次鹽析即將六步鹽析得到的上清液，加入(NH4)2SO4使其飽和度達(dá)到23%，4℃靜置12 h，離心，上清液飽和度追加至35%，4℃靜置12 h，離心，沉淀用PBS溶解后測其吸光度，如此反復(fù)多次。通過對比二步鹽析、四步鹽析、六步鹽析以及多次鹽析(NH4)2SO4飽和度對PC純度和回收率的影響，可分析得知多次分段鹽析的回收率雖然僅有9.66%，但PC 純度高達(dá)3.92。

一般的鹽析方法主要是先用(NH4)2SO4等鹽類使PC析出，而后再利用層析等方法分離提純蛋白質(zhì)，步驟繁瑣，而多步鹽析法通過多次的分離而達(dá)到提純目的，更加簡易方便。

1.2 雙水相萃取法

雙水相萃取技術(shù)(aqueous two-phase extraction，ATPE)，又稱水溶液兩相分配技術(shù)(partion of two aqueous phase extraction)［9］，其原理主要是:在一定濃度下，2種水溶性不同的聚合物或者一種聚合物和無機(jī)鹽的混合溶液體系會自然分成互不相容的兩相，形成雙水相體系，被分離物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，在表面性質(zhì)、電荷間作用和各種作用力(疏水鍵、氫鍵和離子鍵)等因素的影響下，兩相間的分配系數(shù)不同，導(dǎo)致上下相的濃度不同而達(dá)到分離的目的［10］。雙水相萃取是一種新型的生物分離技術(shù)［11］，可用于PC的分離提純。

劉楊等［12］采用反復(fù)凍融的方法將鈍頂螺旋藻藻體破碎后，將獲得的PC粗提液加入一定量的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和無機(jī)鹽中，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解，完成了PC在雙水相系統(tǒng)中的分配過程。此雙水相系統(tǒng)靜置一定時間，當(dāng)兩相達(dá)到相分離后，分別抽取上下相的溶液，在波長280、620、650 nm下測吸光度，計(jì)算PC的質(zhì)量濃度和純度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)中雙水相萃取分離得到的PC純度為2.1，比采用鹽析沉淀與層析分離相結(jié)合方法分離出的PC純度低 3.4，但其操作簡便［13］。

對比鹽析的過程，雙水相萃取法不僅節(jié)省了分離提純的時間，簡化了操作步驟，而且處理?xiàng)l件較為溫和，可較好地保持蛋白質(zhì)的活性［14-15］。然而，相比只考慮鹽溶液的鹽析過程來說，雙水相萃取提純PC需要考慮聚合物的濃度、種類、平均分子質(zhì)量等因素，對于環(huán)境的要求較為苛刻。

1.3 鹽析結(jié)合雙水相萃取提取純化法

鹽析結(jié)合雙水相萃取法(salting out combined two-aqueous phase extraction)是劉清新等［16］研究出的一種采用鹽析和雙水相萃取相結(jié)合的新型方法。此方法先用飽和度為35% ～75%的(NH4)2SO4溶液沉淀PC，再用飽和度為10% ～30%的(NH4)2SO4除去螺旋藻雜蛋白，而后在雙水相系統(tǒng)中采用8%PEG 4000、16%檸檬酸鈉和4%KCl分離純化鹽析后的PC。即先進(jìn)行(NH4)2SO4的反復(fù)梯度鹽析，而后將反復(fù)鹽析后的PC溶液置于雙水相系統(tǒng)中，達(dá)到分離提純的目的。結(jié)果證明，經(jīng)鹽析結(jié)合雙水相萃取提取純化后的PC純度可達(dá)4.0。

此方法結(jié)合了2種分離提純PC的方法，雖然步驟較為繁雜，耗時較長，同時要兼顧影響2種方法的因子，但它大大提高了蛋白質(zhì)的純度，同時也為運(yùn)用多種方法分離蛋白質(zhì)提供了一個先例。

1.4 反膠團(tuán)萃取法

反膠團(tuán)萃取(reversed micellar extraction)是近年來一種新型的蛋白質(zhì)分離提純方法，它是利用表面活性劑在有機(jī)相中形成的反膠團(tuán)(reversed micelles)形成分散的親水微環(huán)境，從而使生物分子在有機(jī)相(萃取相)內(nèi)存在于反膠團(tuán)親水微環(huán)境中，解決了蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)難溶解于有機(jī)相中或在有機(jī)相中發(fā)生不可逆變性的問題。由于此方法選擇性高、萃取過程簡單［17］，可有效保護(hù)蛋白質(zhì)大分子，因此成為提取PC的新型方法之一。

甘林火等［3］將地木耳細(xì)胞分離獲PC粗提液，同時將配制好的陽離子十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)反膠團(tuán)溶液與粗提液充分混合、靜置分層，將油水兩相分離(油相為反膠團(tuán)萃取液)，抽取上相(油相)溶液并測定其PC含量，向油相中加入不同pH值的無機(jī)鹽KBr溶液，使兩相充分混合，PC達(dá)到分配平衡。再次靜置分層，將油水兩相分離，水相為反膠團(tuán)反萃取液，抽取下相(水相)溶液并測定其PC含量。最終得到了最佳分離條件為0.05 mol/L CTAB/正己醇-正辛烷(體積比1∶4)的反膠團(tuán)體系用于萃取pH=7.0的地木耳細(xì)胞破碎液，PC萃取率可達(dá)98.1%，分配系數(shù)達(dá)到50.7;采用 pH=4.0、3 mol/L KBr反萃液反萃取 PC，反萃率可達(dá)98.5%，其純度可達(dá)16.8。

劉楊等［18］將加入磷酸緩沖液的螺旋藻粉采用反復(fù)凍融技術(shù)破碎藻體細(xì)胞，獲得藻膽蛋白粗提液，并與CTAB反膠團(tuán)溶液混合后離心，反復(fù)提取水相溶液，在568、620和650 nm下測吸光度，計(jì)算PC的含量。此外，劉楊等還分析了鹽離子種類和濃度等對萃取效果的影響。

利用反膠團(tuán)萃取法提純PC可以有效地防止其變性，蛋白質(zhì)的純度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過4.0，純度大幅度提高，此類方法可適用于對蛋白質(zhì)純度要求較高的醫(yī)療行業(yè)。

1.5 殼聚糖親和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25柱層析法

針對傳統(tǒng)PC純化能耗高、損失大、耗時長等缺點(diǎn)，廖曉霞［6］等探究出了殼聚糖親和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25柱層析(chitosan affinity precipitation-activated carbon adsorption-DEAE Sephadex A-25 column chromatography)三步法分離純化PC方法(圖1)。通過分析殼聚糖親和沉淀?xiàng)l件，活性炭吸附，DEAE Sephadex A-25凝膠層析洗脫曲線以及PC的光譜特性，得出向PC粗提液中加入0.29%殼聚糖，調(diào)節(jié)pH值至6.9，攪拌5 min后，離心棄沉淀，向上清液中加入80 g/L活性炭吸附5 min，離心、超濾濃縮上清液，采用DEAE Sephadex A-25柱層析法，用10 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)+0.1 ～0.3 mol/L NaCl梯度洗脫得純度達(dá)到4.3的PC。

此方法所需材料成本低、考慮因素較少、條件溫和、不易使蛋白質(zhì)變性，可適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，然而相比反膠團(tuán)萃取法提純蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)純度較低。

圖1 殼聚糖親和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25柱層析法提純PC工藝流程Fig.1 Process of phycocyanin purification by chitosan affinity precipitation-activated carbon adsorption-DEAE Sephadex A-25column chromatography

1.6 離子交換色譜與疏水間相互作用色譜結(jié)合法

離子交換色譜與疏水間相互作用色譜結(jié)合法(combined ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography)是將提取后的PC先后經(jīng)過離子交換色譜法、疏水間相互作用色譜法來進(jìn)一步純化PC。Santiago-Santos等［19］將從稻田中分離的絲狀藍(lán)藻，經(jīng)一定條件培養(yǎng)后離心分離，沉淀懸浮于10 mL 0.1 mol/L、pH=7 磷酸鹽緩沖液中(含有 13.6 mmol/L的EDTA和2 mg單位濕重為2 mg/g溶解酶)，懸浮液靜置24.5 h使細(xì)胞破碎，經(jīng)再次離心后獲PC粗提物。粗提物用50 mmol/L pH=7.5 Tris-HCl緩沖液(經(jīng)過PD10柱)平衡，使其可以在相同的條件下進(jìn)行離子交換。進(jìn)行離子交換色譜時，首先將樣品裝入經(jīng)50 mmol/L、pH=7.5的Tris-HCl緩沖液平衡后的Q-Sepharose 4快速流動柱中，用14 mL相同的緩沖液洗脫，吸附的蛋白質(zhì)被10 mL具有線性梯度(0 ～0.6 mol/L)的 NaCl緩沖液(50 mmol/L、pH=7.5的Tris-HCl)洗脫，收集 A620/280檢測后大于1.5的組分與1.3 mol/L的(NH4)2SO4混合，隨后將其裝入用pH=7.5 Tris-HCl緩沖液平衡后的且含有 1.3 mol/L的(NH4)2SO4甲基宏觀準(zhǔn)備柱，用30 mmol/L平衡緩沖液洗脫，蛋白質(zhì)用25 mL含有線性梯度(0 ～1.3 mol/L)的(NH4)2SO4洗脫，收集 A620/280檢測后大于3.5的組分。

此方法在預(yù)處理過程中未采用反復(fù)凍融法，而是通過生化手段使細(xì)胞破碎，通過增加細(xì)胞的破碎程度來提高回收率。然而，此方法在預(yù)處理方面所需時間較長，純化步驟也較為繁瑣，不適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

上述主要介紹了近年來研究的6種PC的分離純化方法，這些方法各有優(yōu)勢，也各有不足之處(表1)。在考慮實(shí)際應(yīng)用時，需要根據(jù)實(shí)際情況，例如是否可以工業(yè)化生產(chǎn)、純化率、回收率等，選用適當(dāng)?shù)姆蛛x提純方法。

表1 PC分離純化技術(shù)方法對比Table 1 Comparison on advantages and disadvantages of phycocyanin separation and purification technologies

2 影響PC分離提純的因素

當(dāng)選用適當(dāng)?shù)腜C分離提取方法時，為達(dá)到盡可能大的回收率、純化率，節(jié)省時間，需要考慮各種影響因子(表2)，對每個因子的適用條件加以分析，使其達(dá)到最優(yōu)化的程度，進(jìn)而達(dá)到更好的提純效果。

2.1 鹽析次數(shù)

此因素主要影響與鹽析過程有關(guān)的方法，例如多步鹽析法［8］和鹽析結(jié)合雙水相萃取法［16］。王巍杰等［8］在提取PC時進(jìn)行了多次分段鹽析，分析了鹽析次數(shù)對PC回收率和純度的影響。在4次鹽析實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得出，隨著鹽析次數(shù)的增多，PC的回收率降低，但PC的純度呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，純度在第3次的鹽析操作中(23%除雜，35%沉淀PC)最高，為3.92，表明增加鹽析次數(shù)可在一定程度上提高蛋白質(zhì)的純度，然而過多次數(shù)的鹽析則會適得其反，因此需要經(jīng)多次試驗(yàn)找出最適的鹽析次數(shù)，使PC純度的達(dá)到峰值。

2.2 聚合物平均分子質(zhì)量

此因素主要影響與雙水相萃取過程有關(guān)的方法，例如雙水相萃取法［12］和鹽酸結(jié)合雙水相萃取法［16］。PEG的平均分子質(zhì)量極大程度地影響著雙水相體系的平衡。劉楊等［12］選用了平均分子質(zhì)量分別為600、1 000、2 000、4 000、6 000，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10% 的PEG，觀察溶液的分層情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PEG分子質(zhì)量為4 000時，溶液開始出現(xiàn)分層現(xiàn)象。因此，在相同的聚合物和無機(jī)鹽濃度下，PEG平均分子質(zhì)量低的溶液不能形成雙水相體系，PEG分子質(zhì)量越大，越容易形成雙水相體系，但PEG分子質(zhì)量過大，不會對PC純度有明顯的提高作用。

2.3 表面活性劑的濃度

此因素主要影響反膠團(tuán)萃取法的提純效率。劉楊等［18］采用濃度分別為 0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L的CATB陽離子表面活性劑，從PC的萃取現(xiàn)象、萃取率、分配系數(shù)、分離因數(shù)方面分析表面活性劑濃度對反膠團(tuán)萃取PC的影響。通過實(shí)驗(yàn)可知，隨著CATB濃度的增加，油水液面變得逐漸清晰，PC的萃取率和分配系數(shù)都在逐漸增加，CATB濃度在0.04 mol/L最好，然而分離因數(shù)的變化卻不顯著。而且，當(dāng)CTAB濃度增加到一定程度(高于0.05 mol/L)時，有機(jī)相黏度增大的程度會影響油水兩相的分層速度，因此在利用反膠團(tuán)萃取法萃取PC時，0.04 mol/L為較適合的陽離子活性劑濃度。

2.4 活性炭加入量

該因素主要針對殼聚糖親和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25柱層析法對PC的提純效果。廖曉霞等［6］的研究表明，活性炭可用來純化PC。實(shí)驗(yàn)表明，用活性炭處理PC粗提液5 min，即可達(dá)到純化PC的目的，但處理時間的過度延長，不但不能進(jìn)一步提高PC的純度，反而較大程度地影響了PC的得率。為進(jìn)一步研究出活性炭加入量對藍(lán)藻蛋白提純效果的影響，他們采用濃度分別為20、40、60、80、100 g/L的活性炭，分析PC的得率和純度。結(jié)果表明，隨著活性炭濃度的增加，PC的得率逐漸降低，純度則呈現(xiàn)一個峰值。因此，在考慮了PC的得率和純度因素后，活性炭的最適濃度選擇為出現(xiàn)純度峰值時所對應(yīng)的活性炭濃度(80 g/L)。

表2 PC分離提取方法及其主要影響因素Table 2 Main influencing factors of phycocyanin separation and purification technologies

3 現(xiàn)有問題與建議

盡管人們對于PC有了一定的關(guān)注，研究人員也研制出了多種提純方法來滿足人們對于PC的需要，但目前我國對PC分離提取方法的研究還不夠完善，主要表現(xiàn)在以下幾點(diǎn):

(1)現(xiàn)有PC分離提純技術(shù)在產(chǎn)品安全方面有待完善。近年來，由于工業(yè)廢水造成的環(huán)境重金屬污染，例如鉻污染以及水體富營養(yǎng)化造成的有毒藻類污染、微囊藻毒素污染，使藻類原料面臨著重金屬和藍(lán)藻毒素污染的風(fēng)險［27-30］，對PC的質(zhì)量造成威脅。然而，在PC的分離提純中，鮮有去除重金屬、藻類毒素的考量和相關(guān)檢驗(yàn)等工序，這給PC的使用安全性，特別是醫(yī)療保健和化妝品等行業(yè)，無法提供完全的保障。因此，在將來的PC分離純化技術(shù)研究中，要這種解決重金屬和藍(lán)藻毒素污染去除的問題。

(2)提取PC時所用的化學(xué)試劑得不到較好處理，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。例如，在PC的提純過程中研究人員可能用到(NH4)2SO4試劑，如處理不當(dāng)排入水中，會造成氨氮污染。2009年《中國環(huán)境統(tǒng)計(jì)年報(bào)》顯示，我國廢水中的氨氮排放總量已達(dá)122.6萬t，相當(dāng)于受納水體環(huán)境容量的4倍左右。其中化工等以高濃度氨氮廢水為主的8個行業(yè)的氨氮排放量占全國工業(yè)氨氮排放總量的85.9%。水中氨氮在一定條件下可轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，如果長期飲用，水中的亞硝酸鹽將和蛋白質(zhì)結(jié)合成亞硝胺，亞硝胺是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，嚴(yán)重影響人體健康［31］。因此，要特別注意提取技術(shù)的應(yīng)用，不能造成環(huán)境水體污染。

(3)現(xiàn)有PC分離純化技術(shù)的產(chǎn)品品質(zhì)不理想。例如，現(xiàn)在常用的多步鹽析法，雖節(jié)省操作成本，但回收率卻較低;雙水相萃取法雖然萃取條件溫和，但不易與聚合物分離。由此可見，每一種方法都有其優(yōu)勢，同時存在不足之處，進(jìn)而影響提純PC的品質(zhì)。

針對上述3個方面問題，建議從下述3個途徑加以解決:

(1)研究人員應(yīng)該注重改善水體中氮、磷的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，抑制有毒藻類的生長方法的研究［31］，研究對諸如重金屬和藍(lán)藻毒素等易摻入PC中的有害物質(zhì)的特殊有效的檢測方法，例如高效液相色譜檢測或酶聯(lián)免疫吸附檢測［33］，以進(jìn)一步提高PC的純度，保證PC質(zhì)量安全性。同時，要讓人們正確認(rèn)識PC的成本與價格的關(guān)系，對價格低廉的PC，人們應(yīng)注意其純度和添加物。

(2)加大對相關(guān)化學(xué)藥品的回收處理力度，加強(qiáng)對回收化學(xué)藥品有效處理方法的研究，嚴(yán)禁私自將化學(xué)試劑傾倒入河流湖泊，對于工業(yè)用或化學(xué)用藥品要預(yù)先做好方案規(guī)劃，進(jìn)行多部門的綜合監(jiān)督和多學(xué)科參與的研究，避免環(huán)境污染和資源浪費(fèi)［34］。

(3)研究開發(fā)新技術(shù)，鼓勵研究人員對蛋白質(zhì)提純方法的創(chuàng)新。可將不同的蛋白質(zhì)技術(shù)提純方法組合，彌補(bǔ)相互缺陷，達(dá)到更大地提高蛋白質(zhì)純度的目的。例如王巍杰等［8］采用多步鹽析法獲得的PC的純度為3.92，而劉清新等［16］采用鹽析結(jié)合雙水相萃取法純度可達(dá)4.0。

4 展望

PC有著多重作用，它可以作為天然色素，應(yīng)用于食用工業(yè)和化妝品行業(yè)中;可以作為醫(yī)藥保健用品，起到抗氧化、消炎等功效;也可以因其熒光特性而作為生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等學(xué)科的研究試劑，應(yīng)用前景十分廣闊。此外，我國幅員遼闊，淡水藻類資源豐富，PC生產(chǎn)有著充足的原料來源。然而，僅僅有豐富的資源還不夠，一方面，市場內(nèi)高純度的PC已被國外壟斷，其售價極高，例如食品級的PC(純度高于0.7)售價達(dá)到0.13 US$/mg，分析級的PC(純度高于4.0)售價達(dá)到15 US$/mg;另一方面，我國對于PC的研究開發(fā)大都處于實(shí)驗(yàn)室水平，其成熟的工藝技術(shù)還需要一段時間的研究探索［35-37］。因此，還需要加大分離提純方法的研究力度，從提純技術(shù)方法組合、儀器設(shè)備使用、環(huán)境保護(hù)、PC質(zhì)量安全和PC質(zhì)量保證［38］等方面盡快研究出既可以提高純度、加大回收率、節(jié)省時間，又可以節(jié)約成本、適合于工廠化生產(chǎn)的最優(yōu)化方法。

［1］ 尹興娟，唐愛國，劉繼憲，等.藻藍(lán)素的提取及其光學(xué)性質(zhì)的研究［J］.應(yīng)用化工，2010，39(4):484-490.

［2］ 蘇明星，廖智，劉少華，等.魚腥藻藻藍(lán)蛋白的提取·分離純化和抑菌研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(8):4 866-4 918.

［3］ 甘林火，翁連進(jìn).反膠團(tuán)萃取分離地木耳中藻藍(lán)蛋白［J］.化工進(jìn)展，2010，29(12):2362-2367.

［4］ 王勇，錢凱先，董強(qiáng)，等.高純度藻藍(lán)蛋白分離純化及光譜特性研究［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1999，26(5):457-459.

［5］ 趙艷景，胡虹，王穎.藻藍(lán)蛋白生理活性及作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(11):6 332-6 490.

［6］ 廖曉霞，張學(xué)武.高效分離純化藻藍(lán)蛋白新法［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(6):273-280.

［7］ Patil G，Raghavarao K S M S.Aqueous two phase extraction for purification of C-phycocyanin［J］.Biochemical Engineering Journal，2007，34:156-164.

［8］ 王巍杰，徐長波，程紅燕.鹽析法分離藻藍(lán)蛋白的研究［J］.食品科技，2010，35(5):238-241.

［9］ 郭憲厚.雙水相萃取技術(shù)研究進(jìn)展［J］.廣州化工，2008，36(5):17-20.

［10］ 戈延茹，曹恒杰.雙水相萃取技術(shù)及其在藥物提取分離中的應(yīng)用近況［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009，26(8):623-627.

［11］ 謝藍(lán)華，杜冰，張嘉怡，等.雙水相萃取技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2012，28(5):234-238.

［12］ 劉楊，王雪青，龐廣昌，等.雙水相萃取法富集分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白的研究［J］.海洋科學(xué)，2008，32(7):30-32，37.

［13］ 王廣策，周百成，曾呈奎.鈍頂螺旋藻C-藻藍(lán)蛋白和多管藻R-藻紅蛋白的分離及其摩爾消光系數(shù)的測定［J］.海洋科學(xué)，1996，20(1):52-55.

［14］ 趙新穎，屈鋒，董敏，等.雙水相萃取結(jié)合液相色譜法分離蛋白質(zhì)［J］.分析化學(xué)，2012，40(1):38-42.

［15］ 于淑坤，岳思軍，田露，等.聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系萃取螺旋藻藻藍(lán)蛋白的研究［J］.食品科技，2012，37(11):249-252.

［16］ 劉清新，郭衛(wèi)芹，王巍杰.鹽析結(jié)合雙水相萃取法提取純化藻藍(lán)蛋白［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械，2011，9:122-125.

［17］ 李宏，王崇均.蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)萃取機(jī)制及動力學(xué)模型研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23:379-383.

［18］ 劉楊，王雪青，龐廣昌.反膠團(tuán)萃取分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白［J］.天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，23(2):30-33.

［19］ Santiago-Santos M C，Ponce-Noyola T，Olvera-Ram＇?rez R，et al.Extraction and purification of phycocyanin from Calothrix sp.［J］.Process Biochemistry，2004，39:2 047-2 052.

［20］ 呂微，蔣劍春，徐俊明.蛋白質(zhì)提取及分離純化研究進(jìn)展［J］.精細(xì)石油化工進(jìn)展，2010，11(11):52-58.

［21］ 張?zhí)苽?，李天?藻膽蛋白質(zhì)的提取純化與生物活性研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010(1):9-13.

［22］ 江詠，李曉璽，李琳，等.雙水相萃取技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2007，28(10):235-238.

［23］ 郭珍，陳復(fù)生，李彥磊，等.反膠束萃取技術(shù)及其在植物蛋白質(zhì)提取中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2013，29(1):240-242.

［24］ Peng X，Yuan X，Zeng G，et al.Extraction and purification of laccase by employing a novel rhamnolipid reversed micellar system ［J］.Process Biochemistry，2012，47:742-748.

［25］ 徐寶財(cái)，王媛，肖陽，等.反膠團(tuán)萃取分離技術(shù)研究進(jìn)展［J］.日用化學(xué)工業(yè)，2004，34(6):390-393.

［26］ 張莉麗，張?zhí)m威，杜明，等.凝膠層析和離子交換層析結(jié)合法純化高鹽發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶［J］.分析化學(xué)，2012，40(8):1 225-1 230.

［27］ 胡梁斌，王淼焱，李紅波，等.藻藍(lán)蛋白的純化及功能飲料的開發(fā)［J］.河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2011(6):19-22.

［28］ 張少斌，穆楊，劉慧，等.重金屬離子鉻(Ⅵ)對螺旋藻生長的影響［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24(2):145-146.

［29］ 胡碧洋，趙蕾，周文靜，等.我國水華藍(lán)藻資源化研究現(xiàn)狀、問題與對策［J］.水生態(tài)學(xué)雜志，2012，33(3):138-143.

［30］ 楊濤，陳華.微囊藻毒素污染現(xiàn)狀及其生殖發(fā)育危害［J］.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，17(2):23-25.

［31］ 謝建華，劉海靜，王愛武.淺析氨氮、總氮、三氮轉(zhuǎn)化及氨氮在水污染評價和控制中的作用［J］.內(nèi)蒙古水利，2011(5):34-36.

［32］ 朱旭宇，江志兵，杜萍.氮磷營養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)對有害藻類的影響［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23(1):152-156.

［33］ 夏商周，楊朝暉.微囊藻毒素的檢測及危害研究進(jìn)展［J］.四川環(huán)境，2012，31(3):90-93.

［34］ 吳新民，鄭向榮，郗艷娟，等.水產(chǎn)品質(zhì)量安全與控制對策［J］.河北漁業(yè)，2011(5):56-57.

［35］ 韓士群，李輝東，嚴(yán)少華，等.太湖藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白的提取及純化［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28(4):777-782.

［36］ Chaiklahan R，Chirasuwan N，Loha V，et al.Separation and purification of phycocyanin from Spirulina sp.using a membrane process ［J］.Bioresource Technology，2011，102:7 159-7 164.

［37］ 陳志桃，王立興，林維欽，等.螺旋藻藻藍(lán)蛋白的研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2003，15(6):1-5.

［38］ Chaiklahan R，Chirasuwan N，Bunnag B.Stability of phycocyanin extracted from Spirulina sp.:Influence of temperature，pH and preservatives［J］.Process Biochemistry，2012，47:659-664.