鮑華燁 周妙妮 許愛娥

人真皮間充質干細胞對白癜風患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞表達和分泌白介素13的影響

鮑華燁 周妙妮 許愛娥

目的探討人真皮間充質干細胞(DMSC)對白癜風患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞分泌表達白介素(IL)13的影響。方法細胞增殖檢測法(MTS)檢測重組IL-13(rIL-13)對黑素細胞增殖的影響。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western印跡法分別檢測6例進展期尋常型白癜風患者皮損周圍及外周血中CD8+T淋巴細胞中IL-13基因和蛋白表達。實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)技術和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測DMSC與白癜風患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞共培養(yǎng)前后細胞IL-13 mRNA水平和上清蛋白水平。結果不同濃度(10、50、100、250、500 μg/L)的 rIL-13 作用黑素細胞 24、48、72、96 h 后黑素細胞的增殖與對照組比較均未見明顯變化(均P＞0.05)。白癜風患者皮損周圍及外周血中CD8+T淋巴細胞均可表達IL-13,但皮損周圍CD8+T淋巴細胞表達IL-13更顯著。將皮損周圍CD8+T淋巴細胞和DMSC共培養(yǎng),CD8+T淋巴細胞IL-13 mRNA(0.100 0±0.002 4)和蛋白［(1 509.62±48.44)ng/L］的表達水平均顯著低于單獨培養(yǎng)的CD8+T淋巴細胞［mRNA:0.383 2±0.018 7,蛋白:(5 507.98±34.11)ng/L,均P＜0.05］。結論白癜風患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞高表達IL-13,DMSC能夠有效地抑制其表達IL-13,或許可作為白癜風的治療靶點之一。

白癜風;CD8陽性T淋巴細胞;間質干細胞;白細胞介素13

白癜風是一種獲得性色素脫失性疾病,該病發(fā)病機制不明,治療困難。研究表明,白癜風皮損周圍真皮淺層內存在大量的CD8+T淋巴細胞浸潤,浸潤的淋巴細胞具有黑素細胞抗原特異性,能選擇性殺傷黑素細胞并引起角質形成細胞凋亡,從而造成正常皮膚的色素減退［1］,可能是白癜風的發(fā)病機制之一,因此抑制白癜風皮損部位CD8+T淋巴細胞的活性,調節(jié)皮損部位的免疫微環(huán)境,可能是治療白癜風的重要手段。間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一類能夠自我更新,具有多向分化能力的干細胞。有研究表明,MSC可誘導活化的T細胞凋亡［2］。我們前期［3］已經將人真皮來源的間充質干細胞(dermal mesenchymal stem cell，DMSC)和白癜風患者CD8+T淋巴細胞共同培養(yǎng),發(fā)現DMSC抑制患者CD8+T淋巴細胞的活性和增殖,并促進其凋亡,而且患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞和DMSC共同培養(yǎng)后,多種細胞因子分泌下降,其中白介素(IL)-13的下降較為顯著［3］。本研究以IL-13為靶點,旨在研究IL-13在DMSC和白癜風患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞介導的免疫反應中可能發(fā)揮的作用。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑和儀器:Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,淋巴細胞分離液購自美國Sigma-Aldrich公司,MACS分選磁珠購自德國Miltenyi公司,SYBR? Premix Ex TaqTM購自日本TaKaRa公司,2×Taq Master Mix、細胞增殖與毒性檢測試劑盒(MTS)均購自美國Omega公司,重組IL-13和抗IL-13單克隆抗體及IL-13 ELISA試劑盒購自美國RD公司。梯度PCR儀購自德國Eppendorf公司,CFX96實時熒光定量PCR儀系美國Bio-Rad公司產品。

2.PCR引物序列:①IL-13,上游5'-ATTGCTC TCACTTGCCTTGG-3',下游5'-CAGGTTGATGCTCC ATACCA-3;②肌動蛋白,上游5'-GTCTTCCCCTCC ATCGTG-3',下游 5'-AGGGTGAGGATGCCTCT CTT-3'。

二、方法

1.CD8+T淋巴細胞的分離和培養(yǎng):6例尋常型白癜風進展期患者中男4例,女2例,年齡18～50歲(平均29歲)。排除伴發(fā)甲狀腺功能亢進、糖尿病、紅斑狼瘡、特應性皮炎、斑禿等自身免疫性疾病者。試驗方案經醫(yī)院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。皮損周圍CD8+T淋巴細胞的分離和培養(yǎng):取患者白斑邊緣的皮膚組織0.5 cm×1.0 cm,去除皮下組織,切成小塊(0.1～0.2 cm2),置于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基,添加抗CD3/CD28抗體磁珠,放入37℃,5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。外周血CD8+T淋巴細胞的分離和培養(yǎng):抽取患者外周血,用淋巴細胞分離液分離獲得外周血單一核細胞(PBMC),將PBMC進行磁珠分選獲得CD8+T淋巴細胞,添加抗CD3/CD28抗體磁珠,置于RPMI1640完全培養(yǎng)基中,放入細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。取對數生長期細胞用于實驗。

2.DMSC的分離和培養(yǎng):標本取自本院泌尿外科健康男性包皮環(huán)切術后表皮組織,剪成小片。用分離酶4℃消化分離表真皮,真皮用0.35%的膠原酶Ⅰ37℃振蕩消化,再加入DNA酶37℃消化后,獲得細胞懸液,接種于含DMSC培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育。經鑒定［4］此細胞符合間充質干細胞的特點,取對數生長期細胞用于實驗。

3.皮損周圍CD8+T淋巴細胞和DMSC共培養(yǎng):參考之前的研究［4］,將 DMSC(細胞濃度為 5×105/ml)接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后,每孔加入新鮮分離純化的CD8+T淋巴細胞(細胞濃度為1×106/ml,1∶2)共培養(yǎng),同時加入抗CD3/CD28抗體磁珠刺激生長,對照組為皮損周圍CD8+T淋巴細胞單獨培養(yǎng),空白組為DMSC單獨培養(yǎng)。72 h后收集細胞和上清。

4.黑素細胞的分離和培養(yǎng):標本取自我院泌尿外科健康男性包皮環(huán)切術后表皮組織,分離表真皮,表皮以胰蛋白酶和乙二胺四乙酸孵育10 min,離心,重懸細胞,培養(yǎng)3 d后加入基因素以去除角質形成細胞和成纖維細胞,繼續(xù)培養(yǎng)。取對數生長期細胞用于實驗。

5.重組IL-13(rIL-13)對黑素細胞增殖影響的測定:參考 Choi等［5］的方法,用 MTS 法,調節(jié)黑素細胞濃度至5×103/ml,以100 μl/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后,分別加入100 μl rIL-13濃度為10、50、100、250、500 μg/L 的黑素培養(yǎng)基, 對照組只加培養(yǎng)基,每組設6個復孔,實驗重復3次。分別培養(yǎng)24、48、72、96 h 后終止培養(yǎng), 分別向對照組、rIL-13處理組每孔加入20 μl MTS溶液,孵育3 h,酶聯(lián)免疫分析儀490 nm處測吸光度值(A)。細胞增殖率=rIL-13處理組A490/對照組A490×100%。

6.反轉錄(RT)-PCR檢測IL-13基因的表達:按照Trizol說明書分別提取皮損周圍和外周血CD8+T淋巴細胞總RNA,紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。反轉錄制備cDNA,RT反應條件:65℃ 10 min,55℃ 30 min,85℃ 5 min。PCR擴增體系包括 12.5 μl 2×Taq Master Mix,1.0 μl引物,2 μl cDNA 模板,9.5 μl無核酸水。反應條件:95℃預變性5 min;95℃變性40 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環(huán);72℃延伸7 min。反應結束后,取反應液進行電泳,確認PCR反應產物。

7.實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測IL-13 mRNA的表達:提取并逆轉錄皮損周圍CD8+T淋巴細胞、DMSC及兩者共培養(yǎng)后的CD8+T淋巴細胞。PCR擴增體系包括cDNA模板2μl,引物 1.0 μl,SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μl,dH2O 9.5 μl,擴增條件:預變性95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃30 s,共40個循環(huán),在每個循環(huán)結束前用LightCycle系統(tǒng)自動檢測熒光產物的量。在實時熒光定量PCR儀上讀取擴增曲線、熔解曲線和Ct值。

8.Western印跡法檢測IL-13蛋白表達:提取皮損周圍和外周血CD8+T淋巴細胞總蛋白-70℃保存。蛋白定量,煮沸變性,電泳并濕轉轉膜,封閉,分別加入抗IL-13抗體及β肌動蛋白抗體,4℃搖床上過夜,洗膜,分別加二抗1 h,洗膜,曝光顯影。以β肌動蛋白作為內參照,用ImageJ圖像分析軟件分析目的蛋白灰度值。

9.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-13蛋白的表達:收集皮損周圍CD8+T淋巴細胞、DMSC及兩者共培養(yǎng)后的CD8+T淋巴細胞的上清液,用雙抗體夾心ELISA法檢測上清液中IL-13的含量,實驗步驟嚴格按試劑盒說明書操作。

10.統(tǒng)計學方法:用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、rIL-13對黑素細胞增殖的影響

通過MTS檢測發(fā)現,用濃度分別為10,50,100,250 μg/L 的 rIL-13 處理黑素細胞 24、48、72、96 h,各處理組黑素細胞的增殖與對照組相比,均P＞0.05,差異無統(tǒng)計學意義,可見,rIL-13對黑素細胞的增殖無明顯影響(表1)。

表1 不同濃度重組白介素-13(rIL-13)對黑素細胞增殖的影響(±s)

表1 不同濃度重組白介素-13(rIL-13)對黑素細胞增殖的影響(±s)

注:n=3,將不同時間點各濃度rIL-13組和對照組比較,均P＞0.05

組別 24 h 48 h 72 h 96 h rIL-13組10 μg/L 1.1728±0.0497 1.3953±0.0300 1.6888±0.0035 1.7577±0.0564 50 μg/L 1.2108±0.0328 1.4210±0.0233 1.7257±0.0645 1.8067±0.1272 100 μg/L 1.2100±0.0163 1.3977±0.0265 1.6677±0.0363 1.8500±0.0838 250 μg/L 1.2100±0.0163 1.4403±0.0537 1.7023±0.0242 1.8317±0.0976對照組 1.2070±0.0820 1.4237±0.0295 1.6990±0.0121 1.8437±0.0451

圖1 白介素(IL)-13在兩組CD8+T淋巴細胞的表達 1a:逆轉錄(RT)-PCR產物電泳圖;1b:Western印跡結果。M:標準參照物;1:患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞;2:患者外周血CD8+T淋巴細胞

二、IL-13在白癜風患者皮損周圍及外周血CD8+T淋巴細胞中的表達

RT-PCR產物電泳示,白癜風患者皮損周圍及外周血CD8+T淋巴細胞均擴增出大小約為150 bp的IL-13基因條帶,提示兩種來源的CD8+T淋巴細胞均表達IL-13基因,并且皮損周圍CD8+T淋巴細胞條帶亮于外周血CD8+T淋巴細胞,表明皮損周圍CD8+T淋巴細胞表達IL-13 mRNA更顯著(圖1a)。Western印跡示,白癜風患者皮損周圍及外周血CD8+T淋巴細胞均可見到相對分子質量17 000的IL-13蛋白特異性條帶,且皮損周圍CD8+T淋巴細胞條帶更明顯,皮損周圍及外周血CD8+T淋巴細胞的IL-13蛋白/β肌動蛋白灰度值比值分別為0.712±0.035和0.225±0.023,兩組細胞相比,差異有統(tǒng)計學意義(t=16.223,P＜0.05),結果表明,皮損周圍CD8+T淋巴細胞表達IL-13蛋白更顯著(圖1b)。

三、DMSC抑制患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞IL-13基因和蛋白的表達

qRT-PCR結果顯示,和DMSC共培養(yǎng)后的患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞IL-13 mRNA表達水平(0.1000±0.0024)明顯低于單獨培養(yǎng)的皮損周圍CD8+T淋巴細胞(0.3832±0.0187),t=37.654,P＜0.05。DMSC抑制CD8+T淋巴細胞分泌IL-13,而其本身幾乎不表達IL-13(0.0064±0.0006)。ELISA結果顯示,患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞與DMSC共培養(yǎng)后,IL-13的表達水平(1509.62±48.44)ng/L顯著低于單獨培養(yǎng)的皮損周圍CD8+T淋巴細胞(5507.98±34.11)ng/L(t=98.321,P＜0.05)。DMSC很少表達IL-13蛋白［(316.57±1.99)ng/L］。

討 論

已經證實白癜風患者皮損周圍有大量黑素細胞抗原特異性CD8+T淋巴細胞浸潤,淋巴細胞的浸潤可導致黑素細胞的損害［6］。MSC是一類多潛能干細胞。研究表明,MSC可抑制絲裂原和抗原提呈細胞誘導的T細胞活化及淋巴細胞的增殖反應,并能調節(jié)淋巴細胞部分細胞因子的分泌［7-8］。人真皮來源的間充質干細胞可抑制皮膚歸巢CD8+T淋巴細胞的增殖,并誘導其凋亡,抑制CD8+T淋巴細胞產生細胞因子和趨化因子［9］。

IL-13為重要的Th2型細胞因子,于1993年第一次描述,在活化的人類T淋巴細胞的分子克隆中被識別［8］。其生物學功能主要包括參與IgE合成,在氣道的結構和炎癥細胞中起重要作用等。在本研究中,我們比較了白癜風患者皮損周圍及外周血CD8+T淋巴細胞表達IL-13的差異,發(fā)現患者皮損周圍CD8+T細胞分泌IL-13更為顯著。IL-13對T細胞的活化沒有直接的影響,但是可通過多種途徑影響Th2型反應,如誘導Th2型細胞募集的趨化因子的表達。本研究中,我們發(fā)現患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞較外周血CD8+T淋巴細胞比較,分泌IL-13更顯著,提示IL-13和CD8+T淋巴細胞的活性可能相關。DMSC具有免疫抑制功能,以往研究［10］提示,不同來源的MSC可以抑制T細胞的活化、增殖以及遷移,進而抑制T細胞的免疫反應。我們將DMSC和患者CD8+T淋巴細胞共同培養(yǎng)后,發(fā)現CD8+T淋巴細胞分泌細胞因子IL-13水平明顯下降,由此推測DMSC抑制CD8+T淋巴細胞的活化、增殖或遷移,從而使CD8+T淋巴細胞分泌的細胞因子減少,包括IL-13。我們將不同濃度的rIL-13加入黑素細胞培養(yǎng)基中,觀察其對黑素細胞增殖的影響,結果發(fā)現培養(yǎng)72 h后,不同濃度rIL-13對黑素細胞的增殖無明顯影響,推測IL-13與黑素細胞的增殖無明顯相關,可能是CD8+T淋巴細胞的活性標志之一,有關IL-13的具體作用機制尚待進一步研究。

綜上所述,本研究提示白癜風患者皮損周圍CD8+T淋巴細胞分泌IL-13,而DMSC能夠免疫抑制CD8+T細胞的功能和活性,抑制CD8+T細胞分泌IL-13,IL-13可能與白癜風皮損周圍的微環(huán)境和CD8+T淋巴細胞的毒性和活性相關。

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2013-02-07)

(本文編輯:尚淑賢)

Effect of human dermal mesenchymal stem cells on the expression and secretion of interleukin-13 by perilesional CD8+T lymphocytes from patients with vitiligo

Bao Huaye，Zhou Miaoni，Xu Aie.Hangzhou Clinical College Affiliated to Anhui Medical University，Department of Dermatology，Third People's Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009，China

Xu Aie，Email：xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo evaluate the effect of human dermal mesenchymal stem cells(DMSCs)on the expression and secretion of interleukin(IL)-13 by perilesional CD8+T lymphocytes from patients with vitiligo.MethodsTissue specimens were obtained from the perilesional region of six patients with active vitiligo，and CD8+T lymphocytes were isolated from both the tissue specimens and peripheral blood of these patients.DMSCs and melanocytes were obtained from the foreskin tissue of healthy males.The 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt(MTS)assay was performed to estimate the effect of different concentrations of recombinant IL-13 on the proliferation of melanocytes，reverse transcripition-PCR and Western blotting to detect the mRNA and protein expressions of IL-13 in perilesional and peripheral blood CD8+T lymphocytes respectively，real-time quantitative reverse transcription (RT)-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to detect the IL-13 mRNA expression in，and IL-13 protein expression in the culture supernatant of，CD8+T lymphocytes before and after coculture with DMSCs，respectively.Statistical analysis was done byttest.ResultsNo obvious changes were observed in the proliferation of melanocytes treated with different concentrations(10，50，100，250，500 μg/L)of recombinant IL-13 for various durations(24，48，72 and 96 hours)compared with untreated melanocytes(allP＞0.05).Both perilesional and peripheral blood CD8+T lymphocytes expressed IL-13，and the expression was stronger in perilesional than in peripheral blood CD8+T lymphocytes.A significant decrease was noted in IL-13 mRNA expression(0.100 0±0.002 4 vs.0.383 2±0.018 7，P＜0.05)and protein level in the culture supernatant((1 509.62±48.44)ng/L vs.(5 507.98±34.11)ng/L，P＜0.05)of CD8+T lymphocytes cocultured with DMSCs compared with monocultured CD8+T lymphocytes.ConclusionsThere is a strong expression of IL-13 by perilesional CD8+T lymphocytes in patients with vitiligo，which may be inhibited by DMSCs and serve as a target for the treatment of vitiligo.

Vitiligo；CD8-positive T-lymphocytes；Mesenchymal stem cells；Interleukin-13

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.007

國家自然科學基金(81071294,81271758);浙江省自然科學基金(Z2100973)

310009杭州,安徽醫(yī)科大學附屬杭州臨床學院,杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

許愛娥,Email:xuaiehz@msn.com