祝逸平 王遂泉 李陽 周妙妮 許愛娥

局部針刺對莫諾苯宗誘導C57BL/6小鼠白癜風樣模型的影響

祝逸平 王遂泉 李陽 周妙妮 許愛娥

目的探討外傷對莫諾苯宗誘導白癜風小鼠脫色的影響。方法將40只C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、針刺組和針刺配合莫諾苯宗組4個組,每組10只。模型組應用40%莫諾苯宗乳膏誘導C57BL/6小鼠脫色,建立白癜風動物模型;針刺配合莫諾苯宗組通過針刺配合40%莫諾苯宗乳膏的方法,研究針刺對小鼠脫色的影響。實驗過程中肉眼觀察毛發(fā)顏色以及共聚焦激光掃描顯微鏡(RCM)觀察皮膚脫色。實驗結(jié)束后麻醉小鼠,取非用藥部位脫色皮膚行組織學檢查,HE染色檢測淋巴細胞浸潤情況,免疫熒光染色檢測CD8+T細胞表達。結(jié)果模型組小鼠在用藥部位及非用藥部位均有不同程度脫色。針刺配合莫諾苯宗組小鼠同樣具有以上特點,且其脫色出現(xiàn)時間早,面積大并穩(wěn)定。實驗第65天,模型組和針刺配合莫諾苯宗組用藥部位的脫色面積指數(shù)分別為3.45±0.17和3.90±0.25,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義,t=7.433,P＜0.05;非用藥部位分別為1.90±0.12和2.85±0.27,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義,t=7.529,P＜0.05。免疫熒光顯示非用藥部位脫色區(qū)CD8+T細胞熒光強度模型組為175.528±10.711,針刺配合莫諾苯宗組為645.928±12.652,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義,t=8.105,P＜0.05。針刺配合莫諾苯宗組在非用藥部位脫色斑局部淋巴細胞和CD8+T細胞浸潤更明顯。結(jié)論局部皮膚屏障破壞可以促進莫諾苯宗誘導的白癜風小鼠脫色。

莫諾苯宗;針刺;白癜風;模型,動物

白癜風是一種皮膚黏膜色素脫失性疾病,其病因及發(fā)病機制尚未明確。至今無法提供一個可靠的模型,充分研究該疾病的機制和治療。莫諾苯宗是一種皮膚脫色劑,早在1939年Oliver等發(fā)現(xiàn)在皮革廠工人橡膠手套中莫諾苯宗能引起皮膚色素脫失,這種色素脫失與職業(yè)暴露性的白癜風無明顯差異［1］。本課題組已利用莫諾苯宗成功建立白癜風動物模型［2］,研究外傷對莫諾苯宗誘導小鼠脫色的作用,進一步驗證該模型與人白癜風的相似性。

材料與方法

一、材料

1.動物來源:C57BL/6小鼠,雌性,體質(zhì)量(15±2)g,購于上海斯萊克實驗動物有限公司［生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2012-0002］,在常規(guī)實驗室條件下飼養(yǎng)。

2.主要儀器和試劑:莫諾苯宗購自美國Sigma公司,由杭州市第三人民醫(yī)院制劑室制備成不同濃度乳膏。皮膚共聚焦激光掃描顯微鏡(RCM),美國微維Vivascope 1500型,波長830 nm,最大輸出16.0 mW;免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM),Fluo View FV1000型購自日本Olympus公司。

二、方法

1.分組:C57BL/6小鼠40只,隨機分為陰性對照組、模型組、針刺組、針刺配合莫諾苯宗組4個組,每組10只,在小鼠背部2 cm×2 cm范圍內(nèi)脫毛,涂藥。陰性對照組涂抹凡士林乳膏50 mg每日1次;模型組涂抹40%莫諾苯宗乳膏50 mg每日1次;針刺組在小鼠背部2.5 cm×2.5 cm范圍內(nèi)均勻針刺15下每3天1次;針刺配合莫諾苯宗組在小鼠背部2.5 cm×2.5 cm范圍內(nèi)均勻針刺15下每3天1次,并在2 cm×2 cm脫毛部位涂抹40%莫諾苯宗乳膏50 mg每日1次。各組小鼠用藥50 d,停藥后連續(xù)15 d肉眼觀察小鼠毛發(fā)顏色和脫色面積變化,通過RCM觀察皮膚脫色。

2.毛發(fā)脫色評估:每日肉眼觀察毛發(fā)脫色,并進行積分記錄［3］。將脫色部位分為用藥部位和非用藥部位,每個部位總分為5分,每只小鼠共10分。小鼠毛發(fā)脫色評分標準:0分為毛發(fā)無脫色,1分為毛發(fā)脫色面積0～10%,2分為毛發(fā)脫色面積11%～25%,3分為毛發(fā)脫色面積26%～50%,4分為毛發(fā)脫色面積51%～75%,5分為毛發(fā)脫色面積76% ～100%。

3.皮膚脫色觀察:應用激光共聚焦顯微鏡實時觀察建模前后小鼠正常區(qū)和脫色區(qū)皮膚處在同一層面進行觀察皮膚內(nèi)黑素細胞,并拍照。

4.組織病理:取小鼠非用藥部位脫色區(qū)域的軀干部皮膚進行HE染色和CD8+T細胞免疫熒光染色,并用CLSM檢測CD8+T細胞的熒光定量表達,用單一綠色熒光通道觀察,在488 nm波長以上掃描觀察,并由計算機自帶掃描分析軟件測定,每張切片選取熒光表達最強的5個視野(×200),計算單位面積CD8+T細胞的熒光強度。

結(jié) 果

一、建立白癜風模型

(一)脫色過程:

1.模型組小鼠:①用藥部位:第17天,用藥部位出現(xiàn)少量斑點狀脫色斑,第21天全部小鼠用藥部位均出現(xiàn)斑點狀脫色斑,第25～30天形成斑片狀脫色斑(圖1a,紅色圓圈),連續(xù)用藥至第50天,皮損逐漸擴大并有部分融合;②非用藥部位:軀干部位在第27天出現(xiàn)粟粒狀脫色斑,第50天有5只小鼠出現(xiàn)脫色斑,皮損擴大成黃豆大(圖1a);尾部第37天出現(xiàn)粟粒大小脫色斑,第50天有5只小鼠出現(xiàn)脫色現(xiàn)象(圖1b),且有2只小鼠耳部出現(xiàn)針尖樣脫色斑。停藥后繼續(xù)觀察15 d,發(fā)現(xiàn)除1只小鼠出現(xiàn)少量復色,3只小鼠軀干的非用藥部位脫色面積有擴大跡象外,其余小鼠脫色穩(wěn)定。該組小鼠脫色均從用藥部位出現(xiàn)脫色,再在非用藥部位出現(xiàn)脫色。

2.陰性對照組小鼠:以凡士林外用50 d,未出現(xiàn)脫色斑(圖1c)。

(二)RCM觀察皮膚脫色:正常小鼠皮膚可見色素正常,色素分布均勻,折光性強(圖2a);模型組小鼠非用藥區(qū)脫色部位皮膚可見色素缺失,折光弱(圖2b)。

(三)組織病理:HE染色顯示,模型組在真皮淺層有淋巴細胞浸潤,陰性對照組僅有少量淋巴細胞浸潤。

免疫熒光顯示:模型組在真皮淺層有CD8+T細胞浸潤(圖3a),陰性對照組極少量浸潤(圖3b)。

二、針刺對莫諾苯宗誘導小鼠脫色的影響

(一)脫色的發(fā)生率和時間:針刺配合莫諾苯宗組和模型組小鼠用藥部位均出現(xiàn)脫色,非用藥部位脫色的發(fā)生率分別為90%和50%。而單純針刺組中有1只小鼠出現(xiàn)1簇針尖狀脫色,停止針刺后7 d脫色斑開始復色。

針刺配合莫諾苯宗組小鼠用藥部位平均在第13天出現(xiàn)脫色,而模型組為第19天,脫色出現(xiàn)時間延遲6 d。同樣,針刺配合莫諾苯宗組小鼠非用藥部位出現(xiàn)脫色時間也明顯較模型組早,如軀干的非用藥部位出現(xiàn)脫色斑的平均時間為第18天,距離用藥部位較遠的尾部和耳部平均在第29天和32天出現(xiàn)脫色。模型組小鼠軀干的非用藥部位,尾部和耳部脫色斑平均在28 d,38 d和40 d出現(xiàn)。

圖1 各組小鼠脫色情況 1a:模型組小鼠用藥部位脫色斑(紅圈),軀干的非用藥部位脫色斑(箭頭);1b:模型組小鼠尾部脫色斑(箭頭);1c:陰性對照小鼠未見脫色斑 圖2 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察小鼠活體下黑素及黑素細胞 2a:陰性對照小鼠正常皮膚色素正常,分布均勻,折光強(箭頭);2b:模型組小鼠非用藥部位的脫色斑可見色素缺失,折光弱(箭頭) 圖3 CD8+T細胞浸潤的情況 3a:模型組小鼠在真皮淺層CD8+T細胞浸潤;3b:陰性對照組小鼠在真皮淺層極少量CD8+T細胞浸潤

(二)脫色面積和穩(wěn)定性:針刺配合莫諾苯宗組小鼠脫色面積指數(shù)用藥部位為3.90±0.25,非用藥部位為2.85±0.27;模型組小鼠脫色面積指數(shù)用藥部位為3.45±0.17,非用藥部位為1.90±0.12。針刺配合莫諾苯宗組小鼠用藥部位和非用藥部位脫色面積指數(shù)均較模型組大(t用藥部位=7.433,t非用藥部位=7.529,均P＜0.05),尤其在非用藥部位脫色面積差異明顯。且停藥和針刺后15 d內(nèi)脫色區(qū)穩(wěn)定沒有出現(xiàn)復色,有8只小鼠脫色面積有擴大現(xiàn)象;而模型組中有1只小鼠出現(xiàn)少量復色,3只脫色面積有少量擴大。

(三)CD8+T細胞表達差異:對非用藥部位脫色區(qū)CD8+T細胞進行免疫熒光染色,通過激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察,對單位面積上熒光強度定量發(fā)現(xiàn)對照組免疫熒光切片在綠色背景下極少量CD8+T細胞表達,其熒光強度(61.170±2.051)為熒光背景所致。模型組明顯表達CD8+T細胞,其熒光強度(175.528±10.711),針刺配合莫諾苯宗組在綠色背景中可見明顯增多的高亮CD8+T細胞,其熒光強度為(645.928±12.652),兩者比較t=8.105,P＜O.05,差異有統(tǒng)計學意義。

討 論

莫諾苯宗能引起皮膚色素脫失,早年認為其主要作用于皮膚深層,可以引起健康個體產(chǎn)生白癜風［1，4-5］。隨著近年來對莫諾苯宗研究的深入,明確莫諾苯宗對酪氨酸酶的遍在蛋白化(ubiquitination),可以直接誘導CD8+T細胞反應,殺滅黑素細胞,從而引起皮膚脫色［6］。研究報道［7］利用莫諾苯宗、咪喹莫特乳膏及注射胞嘧啶鳥嘌呤寡聚脫氧核苷酸(cytosine-guanine oligodeoxynucleotides)聯(lián)合治療C57BL/6B16黑素瘤小鼠后在距離莫諾苯宗外用部位較遠區(qū)域出現(xiàn)色素脫失。至今對莫諾苯宗的研究僅限其對黑素瘤的治療及對黑素細胞等細胞學方面的研究,本實驗利用莫諾苯宗建立白癜風動物模型,并研究外傷對莫諾苯宗誘導小鼠脫色的作用。

該模型小鼠脫色過程具有顯著特點:外用莫諾苯宗乳膏后首先在用藥部位出現(xiàn)斑點狀脫色,再在非用藥部位出現(xiàn)脫色,如耳部和尾部等。可能通過溶解莫諾苯宗暴露細胞和釋放相關(guān)細胞因子,引起遠處出現(xiàn)免疫反應,從而引起非莫諾苯宗暴露的黑素細胞產(chǎn)生破壞,導致非用藥部位脫色［8］。這一脫色過程明顯區(qū)別于其他化學脫色劑誘導的白癜風模型,如過氧化氫和氫醌等脫色劑只限于在用藥部位出現(xiàn)白斑［9-10］。此外,模型小鼠非用藥部位真皮淺層CD8+T細胞浸潤明顯,這一特點與人類白癜風皮損處CD8+T細胞浸潤明顯一致［11-13］,符合人類白癜風的細胞免疫反應過程。莫諾苯宗起初通過黑素小體自噬作用和酪氨酸酶的遍在蛋白化作用,提呈黑素小體相關(guān)抗原并在表面產(chǎn)生MHC(主要組織相容性復合物)Ⅰ和Ⅱ分子,直接誘導CD8+T和CD4+T反應,形成黑素細胞特異性抗體,這一現(xiàn)象在白癜風患者體內(nèi)可觀察到［7］。此外,低水平表達的ROS可以加快外源性抗原分泌物的排泄,從而促進樹突細胞提呈黑素細胞特異性抗原,形成CD8+T細胞自身抗原;莫諾苯宗接觸皮膚后形成的醌半抗原可能激活自身免疫反應,NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)的病毒相關(guān)性抗原觸發(fā)炎癥反應,這種自身免疫反應激活樹突細胞分泌Toll樣受體7和9及角質(zhì)形成細胞分泌TLR-9［14］。

本研究還觀察針刺對莫諾苯宗誘導小鼠脫色的影響,在莫諾苯宗用藥和非用藥部位進行針刺,破壞皮膚屏障,結(jié)果顯示該組小鼠較模型組出現(xiàn)脫色斑時間早,面積大,且非用藥部位脫色斑的發(fā)生率高。在停藥和針刺后15 d內(nèi),8只小鼠的脫色斑逐漸擴大,沒有出現(xiàn)復色;而模型組小鼠3只有脫色斑擴大跡象,并有1只少量復色。以上說明外傷可以促進模型小鼠脫色的發(fā)生和發(fā)展。由于針刺破壞局部皮膚屏障,針刺作用可釋放細胞因子引起氧化應激反應,體內(nèi)高活性分子如活性氧等產(chǎn)生過多;且活性氧可以促進來自莫諾苯宗暴露的黑素細胞的外源性抗原分泌物排泄,從而促進樹突細胞提呈黑素細胞特異性抗原,形成CD8+T細胞持久的自身抗原,誘導CD8+T細胞,破壞黑素細胞,引起皮膚脫色［8］。

綜上所述,本研究利用莫諾苯宗建立白癜風動物模型具有合理性,且針刺外傷可以促進該模型小鼠脫色的發(fā)生和發(fā)展,進一步證明該模型與人類白癜風具有共性,可用于白癜風相關(guān)研究。

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2012-12-28)

(本文編輯:尚淑賢)

Effect of local acupuncture on monobenzone-induced vitiligo-like depigmentation in mice

Zhu Yiping，Wang Suiquan，Li Yang，Zhou Miaoni，Xu Aie.Department of Dermatology，Third People‘s Hospital of Hangzhou Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310053，China

Xu Aie，Email：xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo evaluate the effectofinjurieson monobenzone-induced vitiligo-like depigmentation in mice.MethodsForty C57BL/6 mice were randomly and equally divided into four groups：negative control group topically treated with vaseline cream，model group induced by topical monobenzone(40%)cream，acupuncture group receiving acupuncture treatment(15 times)once every three days，and acupuncture combined with monobenzone group receiving both monobenzone induction and acupuncture treatment.The treatment lasted 50 days and mice were sacrificed 15 days after the end of treatment.Hair decolorization was observed with naked eyes，and skin decolorization with reflectance confocal microscopy(RCM)on a daily basis.Tissue specimens were obtained from depigmented skin at monobenzone-uninduced sites，and subjected to hematoxylin and eosin(HE)staining for the cvaluation of lymphocytic infiltration as well as immunofluorescence staining for the detection of CD8+T cell expression.Statistical analysis was done byttest.ResultsVarying degrees of depigmentation were observed in both monobenzone-induced and-uninduced sites in both the model group and acupuncture combined with monobenzone group，and the latter group showed earlier，larger and more stable depigmentation than the former group.At 15 days after the end of treatment，the decolorization area index in the model group and acupuncture combined with monobenzone group was 3.45±0.17 and 3.90±0.25 at monobenzone-induced sites respectively(t=7.433，P＜0.05)，1.90±0.12 and 2.85±0.27 at monobenzone-uninduced sites respectively(t=7.529，P＜0.05).Significant differences were observed in the fluorescence intensity of CD8+T cells at monobenzone-uninduced depigmented sites between the model group and acupuncture combined with monobenzone group(175.528±10.711 vs.645.928 ± 12.652，t=8.105，P ＜ 0.05)，and there was a more evident infiltrate with lymphocytes and CD8+T cells in the monobenzone-uninduced depigmented sites in the acupuncture combined with monobenzone group.ConclusionLocal destruction of skin barrier may promote monobenzone-induced vitiligo-like decolorization in mice.

Monobenzone；Acupuncture；Vitiligo；Models，animal

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.008

國家自然科學基金(81071294);浙江省自然科學基金(Z2100973);杭州市重大科技創(chuàng)新項目(20122513A02)

310053杭州,浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

許愛娥,Email:xuaiehz@msn.com