張寶祥 林茂 段志武 張佃財(cái)

特應(yīng)性皮炎患者外周血皮膚歸巢的CD8+T細(xì)胞研究

張寶祥 林茂 段志武 張佃財(cái)

目的探討特應(yīng)性皮炎(AD)患者外周血CD8+T細(xì)胞皮膚歸巢及殺傷功能相關(guān)蛋白的表達(dá)。方法15例AD患者和14例健康人,用流式細(xì)胞儀,檢測(cè)外周血CD8+T細(xì)胞、表達(dá)皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原的CD8+T細(xì)胞(CLA+CD8+T細(xì)胞)的比例。結(jié)果CD8+T細(xì)胞比例在AD組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);CD8+T細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B和FasL的表達(dá)在兩組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＞0.05)。CLA+CD8+T細(xì)胞比例在AD組(3.80%±1.46%)高于健康對(duì)照組(2.18%±0.85%)(t=3.636,P＜0.01),AD組CLA+CD8+T細(xì)胞比例與SCORAD(SCORing of Atopic Dermatitis)評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.565,P＜0.05);CCR4在CD8+T細(xì)胞表達(dá)在AD組(13.86%±4.42%)高于健康對(duì)照組(9.50%±2.14%)(t =3.738,P＜0.01),而CCR10和CXCR6的表達(dá)在兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CLA+CD8+T細(xì)胞穿孔素的表達(dá)在AD組(74.27%±15.94%)高于健康對(duì)照組(57.20%±14.64%)(t=2.998,P＜0.01),顆粒酶B的表達(dá)在AD組(70.90%±13.85%)也高于健康對(duì)照組(56.41%±11.00%)(t=3.104,P＜0.01),而FasL的表達(dá)在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CLA+CD8+T細(xì)胞CCR4、CCR10和CXCR6的表達(dá)在AD組與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。結(jié)論AD患者外周血CLA+CD8+T細(xì)胞數(shù)量增加,殺傷功能相關(guān)蛋白穿孔素、顆粒酶B的表達(dá)增強(qiáng),可能參與了AD的發(fā)病。

皮炎,特應(yīng)性;CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞;皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原;顆粒酶類;受體,趨化因子

特應(yīng)性皮炎(AD)是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病。近來(lái),CD8+T細(xì)胞在AD發(fā)病機(jī)制中的作用受到重視,而皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(cutaneous lymphocyte-associated antigen，CLA)可介導(dǎo)T細(xì)胞從外周血向皮膚歸巢［1］。細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞需要通過(guò)穿孔素、顆粒酶B、FasL的介導(dǎo)［2］,而AD患者外周血CLA+CD8+T細(xì)胞殺傷功能相關(guān)蛋白的表達(dá)是否存在異常未見報(bào)道。本文擬通過(guò)檢測(cè)AD患者外周血CD8+T細(xì)胞皮膚歸巢及殺傷功能相關(guān)蛋白表達(dá),探討其在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象:2012年5月至2013年1月濰坊市益都中心醫(yī)院皮膚科門診15例AD患者,男8例,女7例,年齡(17±6)歲,所有患者符合Hanifin-Rajka診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］;治療前6個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑,治療前4周內(nèi)未應(yīng)用抗組胺藥及外用糖皮質(zhì)激素。排除標(biāo)準(zhǔn):血常規(guī)、尿常規(guī)、血糖、抗核抗體、C反應(yīng)蛋白等檢查有異常者,伴有如自身免疫性甲狀腺疾病、Ⅰ型糖尿病、斑禿、慢性蕁麻疹、過(guò)敏性哮喘等免疫相關(guān)性疾病者。根據(jù)SCORAD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判定病情嚴(yán)重程度,15例AD患者的 SCORAD評(píng)分為 36.32±24.13［4］。選取 14例健康志愿者作為對(duì)照,男7例,女7例,年齡(20±7)歲,AD組和對(duì)照組之間年齡及性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有入選者均簽署知情同意書。

2.方法:

(1)試劑及儀器:單克隆熒光抗體抗CD3-別藻藍(lán)蛋白(APC)、抗CD8-葉綠素蛋白(PerCP)、抗CLA-異硫氰酸熒光素(FITC)、抗穿孔素-藻紅蛋白(PE)、抗顆粒酶B-PE、抗FasL-PE、抗C-C趨化因子受體4(CCR4)-PE、抗 CCR10-PE、抗C-X-C趨化因子受體6(CXCR6)-PE,同型對(duì)照抗體鼠抗人IgG1-PE和IgG2a-FITC,以及破膜劑(IntraSure Kit)和流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)均源自美國(guó)BD公司。

(2)實(shí)驗(yàn)步驟:抽外周靜脈血3 ml,用肝素抗凝。取400 μl全血,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍,適量PBS重懸;每個(gè)試管中均加入50 μl混懸液,再加入抗CD3-APC和抗CD8-PerCP各6 μl,檢測(cè)各蛋白在CLA+CD8+T細(xì)胞表達(dá)時(shí)再加入抗CLAFITC 6 μl。然后將試管分為兩組:第1組進(jìn)行細(xì)胞膜表面蛋白檢測(cè),即向各試管分別繼續(xù)加入抗FasL-PE、抗CCR4-PE、抗 CCR10-PE或抗CXCR6-PE各6 μl,充分混勻避光孵育15 min,加入溶血素1 ml避光孵育10 min,離心去上清,300 μl PBS重懸,立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè);第2組進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白檢測(cè):先將試管避光孵育15 min,再加入破膜劑A液100 μl避光孵育5 min,加溶血素2 ml并孵育10 min,離心去上清,PBS洗1遍,加破膜劑B液50 μl,分別加入抗穿孔素-PE、抗顆粒酶B-PE各6 μl, 避光孵育 15 min;PBS 洗 1 遍;300 μl PBS 重懸,立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。兩組均設(shè)同型對(duì)照。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組資料間比較用t檢驗(yàn),相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析。

結(jié) 果

1.AD患者外周血CD8+T細(xì)胞的比例及其殺傷功能相關(guān)蛋白的表達(dá):外周血CD8+T細(xì)胞的比例在AD組(38.67%±7.23%)和對(duì)照組(35.14%±6.10%)之間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,圖1);AD組和對(duì)照組之間穿孔素(52.41%±15.65%比50.10% ±14.85%)、顆粒酶B(44.50% ±15.76%比39.39%±13.21%)和FasL(7.37%±3.77%比6.74%±2.65%)表達(dá)率相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

2.外周血CD8+T細(xì)胞皮膚歸巢及歸巢相關(guān)蛋白的表達(dá):外周血CLA+CD8+T細(xì)胞的比例在AD組(3.80%±1.46%)高于對(duì)照組(2.18%±0.85%),t=3.636,P＜0.01(圖1)。同時(shí)對(duì)CD8+T細(xì)胞表達(dá)歸巢相關(guān)蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CD8+T細(xì)胞CCR4表達(dá)在AD組(13.86%±4.42%)高于對(duì)照組(9.50%±2.14%),t=3.738,P=0.01,而AD組和對(duì)照組之間CD8+T細(xì)胞CCR10(36.19%±12.51%比38.52%±10.52%)和CXCR6(8.52%±3.82%比9.65%±3.45%)的表達(dá)率相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均P＞0.05。

AD患者外周血增高的CLA+CD8+T細(xì)胞的比例及CCR4在CD8+T細(xì)胞的表達(dá)率與SCORAD評(píng)分的相關(guān)性,結(jié)果顯示CLA+CD8+T細(xì)胞的比例與SCORAD正相關(guān)(r =0.565,P＜0.05),而CCR4在CD8+T細(xì)胞的表達(dá)率與SCORAD評(píng)分之間無(wú)相關(guān)性(r=0.154,P＞0.05)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD8+T細(xì)胞(a1,b1)、CLA+CD8+T細(xì)胞(a2,b2)的比例 a1,a2:特應(yīng)性皮炎患者;b1,b2:健康人

3.AD患者外周血CLA+CD8+T細(xì)胞殺傷功能相關(guān)蛋白的表達(dá):對(duì)外周血CLA+CD8+T細(xì)胞表達(dá)殺傷功能相關(guān)蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn),穿孔素的表達(dá)在AD組(74.27%±15.94%)高于對(duì)照組(57.20%±14.64%),t=2.998,P＜0.01;同時(shí),顆粒酶B的表達(dá)在AD組(70.90%±13.85%)也高于對(duì)照組(56.41%±11.00%),t =3.104,P＜0.01;但FasL的表達(dá)在兩組間(9.18%±4.32%比8.16%±3.94%)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＞0.05)。

4.AD患者外周血CLA+CD8+T細(xì)胞皮膚歸巢相關(guān)蛋白的表達(dá):對(duì)外周血CLA+CD8+T細(xì)胞表達(dá)歸巢相關(guān)蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在AD組和對(duì)照組之間CLA+CD8+T細(xì)胞CCR4(86.82%±8.86%比83.34%±6.15%)、CCR10(55.28% ±9.08%比53.36% ±7.35%)和CXCR6(1.16%±0.22%比0.92%±0.25%)的表達(dá)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

討 論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CLA+CD8+T細(xì)胞與一些免疫相關(guān)性及炎癥性皮膚病的發(fā)病有關(guān)。Akdis等［5］發(fā)現(xiàn)在AD患者外周血CD45RO+CLA+CD8+T細(xì)胞處于激活狀態(tài),且在皮損中CLA+CD8+T細(xì)胞高表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)AD患者外周血CLA+CD8+T細(xì)胞比例增高,并且與SCORAD評(píng)分正相關(guān),提示CLA+CD8+T細(xì)胞在AD發(fā)病中起作用。AD患者外周血CLA+CD8+T細(xì)胞比例增加的機(jī)制,可能與CLA+T細(xì)胞在皮膚周圍淋巴結(jié)與皮損部位之間的再循環(huán)有關(guān),在周圍淋巴結(jié)處T細(xì)胞在抗原刺激下增殖分化為CLA+T細(xì)胞,該細(xì)胞進(jìn)入皮膚炎癥部位后被再次激活并進(jìn)一步上調(diào)CLA的表達(dá)水平;這些被再次激活的CLA+T細(xì)胞重新進(jìn)入周圍淋巴結(jié),在抗原刺激下再次增殖分化;此再循環(huán)過(guò)程對(duì)于外周血和皮膚CLA+T細(xì)胞的活性及高水平表達(dá)十分重要［6］。

CD8+T細(xì)胞識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞可以通過(guò)兩種途徑實(shí)現(xiàn):一是穿孔素破壞靶細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),然后顆粒酶B等進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),從而激活胞質(zhì)中的蛋白酶,使細(xì)胞發(fā)生凋亡;二是通過(guò)FasL識(shí)別靶細(xì)胞表面的Fas,通過(guò)Fas觸發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)部的凋亡程序,使靶細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡［2］。Yawalkar等［7］研究發(fā)現(xiàn),AD 患者皮損處CD8+T細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B的表達(dá)比正常皮膚明顯增加。另有報(bào)道AD患者角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)FasL水平上調(diào),外周血CLA+CD45RO+T細(xì)胞通過(guò)Fas-FasL途徑激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［8］。本研究發(fā)現(xiàn)穿孔素、顆粒酶B在AD患者外周血CLA+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)升高,提示CLA+CD8+T細(xì)胞可能通過(guò)穿孔素/顆粒酶B介導(dǎo)的殺傷途徑發(fā)揮作用。

T細(xì)胞表面的趨化因子受體與內(nèi)皮細(xì)胞上的趨化因子結(jié)合,在CLA介導(dǎo)的T細(xì)胞皮膚歸巢過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用,其中包括CCR4、CCR10和CXCR6。研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血CCR4在CD8+T細(xì)胞的表達(dá)率高于健康人［9］。CCR10在CLA+T細(xì)胞向皮膚炎癥部位歸巢中起重要調(diào)節(jié)作用［10］。CXCR6+CD8+T細(xì)胞的數(shù)量在銀屑病患者外周血及皮損中均增高［11］。本研究發(fā)現(xiàn),CCR4在CD8+T細(xì)胞的表達(dá)在AD患者高于健康人,但CCR10和CXCR6的表達(dá)在兩組間卻沒(méi)有差異,說(shuō)明CCR4而非CCR10和CXCR6可能在CD8+T細(xì)胞相關(guān)的AD發(fā)病機(jī)制中起作用。CCR4、CCR10和CXCR6在CLA+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)在兩組間比較均無(wú)明顯差異,但是與CD8+T細(xì)胞的表達(dá)率較低不同,CCR4、CCR10在兩組間的表達(dá)率均較高,而CXCR6的表達(dá)卻降低,提示趨化因子受體在協(xié)同CLA+CD8+T細(xì)胞皮膚歸巢中作用機(jī)制不同。

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2013-02-16)

(本文編輯:尚淑賢)

Peripheral blood skin-homing CD8+T cells in patients with atopic dermatitis

Zhang Baoxiang*，Lin Mao，Duan Zhiwu，Zhang Diancai.*Department of Dermatology，Yidu Central Hospital of Weifang City，Weifang 262500，Shandong，China

Lin Mao，Email：lmsleeper1981@gmail.com

ObjectiveTo quantify the percentage of CD8+T cells and their expressions of cytotoxic molecules and homing-related chemokine receptors in peripheral blood from patients with atopic dermatitis(AD).MethodsPeripheral blood was obtained from 15 patients with AD and 14 healthy controls.Flow cytometric analysis was performed to determine the percentages of CD8+T cells and CD8+CLA+T cells in the peripheral blood samples，as well as the expression levels of cytotoxic molecules and homing-related chemokine receptors on these cells.Differences in these parameters were analyzed usingttest，and relationship between these parameters was evaluated using Pearson correlation coefficient.ResultsNo significant difference was observed between the patients with AD and healthy controls in the percentage of CD8+T cells，the expressions of perforin，granzyme B，CCR10，CCR6 or FasL on CD8+T cells，or the expressions of CCR4，CCR10，CXCR6 or FasL on CLA+CD8+T cells(allP ＞0.05).A significant increase was noted in the percentage of CLA+CD8+T cells(3.80%±1.46%vs.2.18%±0.85%，t=3.636，P＜0.01)and expression rates of CCR4 on CD8+T cells(13.86% ±4.42%vs.9.50% ±2.14%，t=3.738，P＜0.01)as well as perforin and granzyme B on CLA+CD8+T cells(74.27% ±15.94%vs.57.20% ±14.64%，t=2.998，P＜0.01；70.90% ±13.85%vs.56.41% ±11.00%，t=3.104，P＜0.01)in the patients with AD compared with the healthy controls.ConclusionsThe proportion of CLA+CD8+T cells is increased with enhanced expressions of cytotoxic molecules such as perforin and granzyme B in peripheral blood of patients with AD，which may contribute to the pathogenesis of AD.

Dermatitis，atopic；CD8-positive T-lymphocytes；Cutaneous lymphocyte-associated antigen；Grazymes；Receptors，chemokine

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.006

262500山東省濰坊市益都中心醫(yī)院皮膚性病科(張寶祥、段志武、張佃財(cái));大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚性病科(林茂)

林茂,Email:lmsleeper1981@gmail.com