李 昕 楊巍巍 李旭冉 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053;2.北京市老年病醫(yī)療研究中心分子診斷實(shí)驗(yàn)室，北京100053)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是臨床上常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一。早期表現(xiàn)為非運(yùn)動(dòng)癥狀(non-motor symptoms，NMS)可達(dá)數(shù)年，如嗅覺(jué)障礙、胃腸功能紊亂、便秘、睡眠紊亂等。晚期PD特征性病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性、進(jìn)行性丟失，殘存神經(jīng)元中有路易體(Lewy body)，其主要成分為聚集的 α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)。文獻(xiàn)［1-3］報(bào)道，PD病程進(jìn)展有可能是由于α-Syn由胃腸道神經(jīng)叢擴(kuò)散到相聯(lián)的神經(jīng)系統(tǒng)，累及延髓之后，伴隨損傷神經(jīng)元數(shù)量的增加而出現(xiàn)臨床癥狀。α-Syn參與神經(jīng)元生長(zhǎng)、重塑、變性，其磷酸化修飾及寡聚化形成可促進(jìn)神經(jīng)元變性［4］。α-Syn單體形成在正常發(fā)育的神經(jīng)元核及突觸表達(dá)，目前認(rèn)為其寡聚化修飾后有毒性［5］。本研究以靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物食蟹猴為模型，應(yīng)用Western blotting法及 ELISA方法證實(shí) oligo-α-Syn和α-Syn在消化道不同部位中的表達(dá)，觀察oligo-α-Syn和α-Syn在不同部位的表達(dá)差異以及與年齡的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

健康食蟹猴(4～16歲)9只，購(gòu)自廣西雄森靈長(zhǎng)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(桂)2009-0006，所有動(dòng)物均有詳細(xì)出生檔案和檢疫證書(shū)，動(dòng)物研究方案經(jīng)動(dòng)物福利委員會(huì)(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)認(rèn)證批準(zhǔn)。青年猴3只(4歲)，中年猴3只(10～11歲)，老年猴3只(15～16歲)。兔抗人磷酸化α-Syn多克隆抗體(Santa cruz公司，美國(guó));鼠抗人α-Syn單克隆抗體3D5由本室制備;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉公司)，生物塑化的鼠單克隆抗體(康為世紀(jì)標(biāo)記公司);4-硝基磷酸二鈉鹽(pNPP)(Sigma公司，美國(guó));ELISA 96孔酶標(biāo)板(Corning公司，美國(guó));酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士);其他試劑為分析純。

1.2 方法

1)消化道中寡聚化α-Syn的ELISA檢測(cè):用質(zhì)量濃度為1×10-3g/L的3D5單抗包被96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，4 ℃過(guò)夜，PBST 洗板。10%BSA封閉，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST 洗板。加入倍比稀釋的重組人 α-Syn(0.5 mol/L、0.25 mol/L、0.125 mol/L、0.006 25 mol/L、0.031 25 mol/L、0 mol/L)和待測(cè)樣品，100 μL/孔，37 ℃孵育 2 h，PBST 洗板，然后加入生物素化的3D5(1(10-3g/L)100 μL/孔，37℃孵育2 h，PBST洗板，再加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(1∶5 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗板，最后加入 pNPP，100 μL/孔，37 ℃顯色 30 min，405 nm 處測(cè)定吸光度值。每次每個(gè)樣品重復(fù)3孔，重復(fù)3次。

2)不同年齡段食蟹猴消化道蛋白樣品制備:抽提青、中、老年食蟹猴消化道不同部位的全細(xì)胞蛋白組分，BCA法蛋白定量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)α-Syn寡聚體的免疫印跡分析:分別取20 μg各組蛋白樣品用10%SDS-PAGE分離后，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜與3D5單抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG多克隆抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL法檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較使用單因素方差分析法和均數(shù)兩兩比較LSD方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)寡聚體α-Syn的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

本研究建立的檢測(cè)寡聚化α-Syn的ELISA方法，可以較特異地識(shí)別樣本中的α-Syn寡聚體，而在含有單體α-Syn溶液中，僅能檢測(cè)到極低的信號(hào)，詳見(jiàn)圖1。根據(jù)α-Syn的起始濃度，計(jì)算出本方法的最低檢測(cè)限為～48 ng/孔。

圖1 ELISA特異識(shí)別人α-Syn寡聚體Fig.1 ELISA method to recognize only the oligomeric species of human α-Syn

2.2 寡聚化α-Syn在不同年齡段猴消化道中的表達(dá)差異

ELISA結(jié)果顯示，在老年食蟹猴的食管、胃底、十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中，寡聚化α-Syn質(zhì)量濃度較青年與中年猴顯著增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其中，在胃底、空腸和回腸中，寡聚化α-Syn隨老化增加，呈年齡依賴(lài)性，詳見(jiàn)圖2。

2.3 α-Syn寡聚體在不同年齡段猴消化道中的Western blotting分析

抽提青年、中年、老年3組猴食管、胃底、回腸和結(jié)腸全細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫印跡分析。在老年食蟹猴的食管、胃底、回腸和結(jié)腸中，寡聚化α-Syn質(zhì)量濃度較青年與中年猴顯著增加。其中，在胃底和回腸中，寡聚化α-Syn隨老化增加，呈年齡依賴(lài)性，詳見(jiàn)圖3。

3 討論

利用本室制備的α-Syn單克隆抗體(3D5)同時(shí)作為捕獲抗體與檢測(cè)抗體，筆者建立了可以檢測(cè)寡聚化α-Syn的ELISA方法。本研究利用α-Syn寡聚體與單體標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)此法的敏感度及特異度，發(fā)現(xiàn)其只能檢測(cè)寡聚化α-Syn，并且吸光度值與寡聚化α-Syn濃度呈線性關(guān)系，而對(duì)于單體形式的α-Syn不識(shí)別，提示此法有較高的特異度。本實(shí)驗(yàn)利用上述ELISA方法檢測(cè)青(4歲)、中(10～11歲)、老(15～16歲)3個(gè)年齡組食蟹猴。以食蟹猴的年齡梯度作為自然老化的模型，研究α-Syn寡聚化在消化道不同部位肌間神經(jīng)叢表達(dá)量與年齡的關(guān)系。

圖2 寡聚化α-Syn在食蟹猴消化道中的表達(dá)Fig.2 Expression of oligo-α-Syn in digestive tract of cynomolgus monkeys

圖3 寡聚化α-Syn在食蟹猴消化道中的Western blotting分析Fig.3 Western blotting for oligo-α-Syn in digestive tract of cynomolgus monkeys

筆者發(fā)現(xiàn)在老年食蟹猴的食管、胃底、十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中，寡聚化α-Syn質(zhì)量濃度較青年與中年猴顯著增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其中，在胃底、空腸和回腸中，寡聚化α-Syn隨老化增加，呈年齡依賴(lài)性。同在食蟹猴結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果類(lèi)似，但是老齡化食蟹猴更易于α-Syn聚集的原因尚不明確。α-Syn的翻譯后修飾可能是原因之一:特殊的激酶如PLK使α-Syn磷酸化、硝基化反應(yīng)，最終使α-Syn沉積形成路易包涵小體［6-8］。α-Syn經(jīng)過(guò)磷酸化、硝基化的翻譯后修飾，形成有毒性的不可溶聚合體，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙和神經(jīng)元的崩解死亡［6，9-10］。此外，老齡化所致內(nèi)環(huán)境改變也可能是促使α-Syn聚集的重要原因。已有研究［6］表明消化道及血漿［1］中α-Syn隨年齡增加而增加，提示自然老化帶來(lái)的α-Syn含量增高，提高了激酶的表達(dá)和氧化應(yīng)激的環(huán)境，促進(jìn)了磷酸化、硝基化的修飾反應(yīng)，最終在老年猴結(jié)腸組織的肌間神經(jīng)叢中高表達(dá)了寡聚化α-Syn。有研究［11-13］指出α-Syn和n-Syn的高表達(dá)與自然老齡化導(dǎo)致的α-Syn寡聚體蓄積增加有密切的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了自然老化對(duì)α-Syn的寡聚體有正向關(guān)系，可增加具有毒性的 oligo-α-Syn聚合物的表達(dá)，但具體的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)α-Syn在PD病理進(jìn)程中可能從外周神經(jīng)系統(tǒng)開(kāi)始的學(xué)說(shuō)［14-15］進(jìn)行了一定程度的驗(yàn)證，需繼續(xù)結(jié)合PD敏感腦區(qū)做深入的機(jī)制研究。在日趨老齡化的現(xiàn)代社會(huì)，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果對(duì)PD典型臨床癥狀未出現(xiàn)的早期診斷提供了一定的指導(dǎo)意義，可以應(yīng)用結(jié)腸鏡檢查技術(shù)和規(guī)范統(tǒng)一的免疫組化技術(shù)，對(duì)老齡高發(fā)人群行臨床前普查，提高早期診斷率。

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