張云巍 徐麗娟 王淑芳 閻 麗*

(1.解放軍總醫(yī)院南樓臨床部消化內(nèi)科，北京100853;2.解放軍總醫(yī)院輸血科干細(xì)胞實驗室，北京100853)

我國是一個乙型肝炎大國，肝炎病毒攜帶率高達(dá)10%［1］;隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活方式的改變，大量飲酒所致的酒精性肝病呈逐年上升趨勢;近年來保健、減肥藥物的使用以及藥物的濫用，藥物性肝病逐年上升;隨著環(huán)境污染的加重，自身免疫性肝病、遺傳性肝病也呈逐年上升趨勢。這些數(shù)目巨大的肝病患者，在經(jīng)歷一定時間后絕大部分將會發(fā)展成為慢性肝病，甚至肝硬化。常規(guī)的內(nèi)科治療雖能改善其臨床癥狀，卻不能逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞數(shù)量日益減少所導(dǎo)致的肝功能的逐漸減退。目前，原位肝移植(orthotropic liver transplantation，OLT)是治療該病最有效手段，但由于存在供肝缺乏、免疫排斥、手術(shù)風(fēng)險、費用昂貴等諸多因素，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用［2］。干細(xì)胞在再生領(lǐng)域所取得的巨大進(jìn)展為慢性肝病的治療提供了新的視角。

干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞，廣泛分布于骨髓［3］、肌肉［4］、臍帶血［5］、外周血［6］、脂肪［7-12］等器官和組織中，能跨胚層分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。Zuk等［13-14］的研究證明人的脂肪組織中含有間充質(zhì)干細(xì)胞，將其稱為人脂肪來源的干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSCs)，根據(jù)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志、基因表達(dá)以及多向分化潛能，表明該細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物特性［14-16］。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便，患者痛苦小，體外擴(kuò)增迅速等優(yōu)點，而且在細(xì)胞治療的應(yīng)用上，在含量［13］及分化能力［17-19］上較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有一定的優(yōu)勢。2005年，Seo等［20］報道脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在相關(guān)生長因子及細(xì)胞因子的作用下，于體外能被誘導(dǎo)為具有白蛋白合成功能及分泌尿素功能的肝臟樣細(xì)胞。這預(yù)示著，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞有望成為肝病細(xì)胞治療理想的種子細(xì)胞。

本課題通過膠原酶消化離心法從脂肪組織中獲取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，研究其生長特性、表面標(biāo)志及多向分化潛能，并在體外探索誘導(dǎo)其向肝臟樣細(xì)胞分化。有望為以細(xì)胞治療為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)提供理想的干細(xì)胞來源，為生物性人工肝及肝組織工程提供種子細(xì)胞，進(jìn)而為終末期肝病及急性肝衰竭患者的治療帶來新希望。

1 材料和方法

1.1 材料

1)儀器:倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱為日本Sanyo公司產(chǎn)品。

2)試劑:胰蛋白酶(EDTA)、雙抗均為美國 Hyclone公司產(chǎn)品;DMEM(Dulbecco's Mldified Eagle's Medium)培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)緩沖液、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)均為美國 Gibco公司產(chǎn)品;Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、吲哚美辛、維生素C、1-甲基3-異丁基-黃嘌呤、β-甘油磷酸鈉、油紅O染色試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色試劑盒、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白、慶大霉素、Triton(聚乙二醇辛基苯基醚)，山羊血清均為美國Sigma公司產(chǎn)品;人表皮細(xì)胞生長因子(human epidermal growth factor，HEGF)為美國Lonza公司產(chǎn)品。激活素A、成纖維細(xì)胞生長因子4(fibroblast growth factor-4，F(xiàn)GF-4)、FGF-1、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、抑瘤素(Oncostatin M，OSM)均為美國Peprotech公司產(chǎn)品;中性甲醛為天津生物制藥公司產(chǎn)品。鼠抗人CD13-PE單克隆抗體、鼠抗人CD73-PE單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、鼠抗人CD45-FITC單克隆抗體、鼠抗人HLADRPE單克隆抗體均為美國Chemicon公司產(chǎn)品;鼠抗人HepPar-1單克隆抗體為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1)人脂肪干細(xì)胞提取:人脂肪組織取自在協(xié)和整形外科醫(yī)院接受腹部吸脂手術(shù)和皮膚瘢痕切除術(shù)的患者，術(shù)前均已簽訂知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。干細(xì)胞分離方法參考Safford等［21］的實驗方法。具體如下:將獲取的脂肪組織用75%乙醇泡30 s，足量的含5%雙抗的4℃ PBS液徹底洗滌10 min，去除肉眼可見的血管及皮膚組織;眼科剪剪碎＜1 mm3。用3倍于脂肪組織的含有1 mg/mLⅠ型膠原酶PBS培養(yǎng)基消化并置于搖床上持續(xù)輕輕搖晃2～3 h，加入等量含10%胎牛血清的低糖DMEM終止消化;室溫孵育10 min，900 g離心10 min。去掉上清及未完全消化的脂肪組織，用5 mL含10%FBS(fetal bovine serum)的 DMEM重懸，80目尼龍篩網(wǎng)過濾，900 g離心10 min。棄上清，用2 mL PBS重懸沉淀1 min，900 g離心5 min。去掉上清，加入2 mL含10%FBS的DMEM重懸沉淀1 min，再以140目過濾，收集濾液。

2)細(xì)胞培養(yǎng):倒置顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞，以1×104/cm2的密度接種于25 mm透氣培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37℃、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天首次換液，以后每3～4 d半量換液1次;待細(xì)胞生長達(dá)90%融合時，用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶，并以1∶2密度傳代擴(kuò)增。

3)細(xì)胞增生能力、表面抗原及多向分化潛能檢測:細(xì)胞增生能力檢測:取第5代細(xì)胞，接種于24孔板，每孔含4×103個細(xì)胞;每天用含有EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)的0.25%胰蛋白酶消化3孔，離心后制成細(xì)胞懸液，在倒置顯微鏡下，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，取其平均數(shù)，以細(xì)胞生長的天數(shù)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

細(xì)胞表面抗原檢測:取生長狀態(tài)良好的第5代hADSCs，胰酶消化，用PBS制成濃度1×106/mL的細(xì)胞懸液。向5個離心管中分別加入100 μL細(xì)胞懸液并分別加入大鼠抗人 CD13-PE、CD73-PE、CD34、CD45-FITC、HLA-DRPE 單抗各 10 μL，4 ℃ 避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

多向分化潛能檢測:取生長良好的第5代hASCs，以1×105/cm2的濃度接種于2個6孔板中，標(biāo)記為實驗組和對照組;加入含10%胎牛血清的hASCs生長培養(yǎng)基2 mL，24 h細(xì)胞貼壁后，實驗組換成成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對照組仍為hASCs生長培養(yǎng)基，以后每3～4 d換液1次。成脂誘導(dǎo)采用細(xì)胞油紅O染色方法檢測，成骨誘導(dǎo)采用細(xì)胞ALP染色方法檢測。

4)向肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo):取生長良好的第5代細(xì)胞，以1×105/cm2的濃度接種細(xì)胞，24 h細(xì)胞貼壁后，試驗組加入含20 ng/mL激活素A(Activin A)，20 ng/mL FGF-4的第一階段培養(yǎng)基，3天后更換為含20 ng/mL EGF，5 μL/mL 慶大霉素，150 ng/mL HGF，100 ng/mL FGF-1，225 ng/mL FGF-4，20 ng/mL 制瘤素 M(OSM)，0.35 μL/mL 地塞米松，0.5 mg/mL 牛血清白蛋白，1 μL/mL 1×胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(ITS)的第二階段培養(yǎng)基，對照組一直使用hASCs生長培養(yǎng)基。

5)RT-PCR法檢測誘導(dǎo)細(xì)胞的基因表達(dá):收集2組細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄;RNA反轉(zhuǎn)錄體系混勻后，30 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，99 ℃ 滅活5 min，獲得的cDNA保存在-20℃。cDNA由特定引物(見表1)按PfuDNA聚合酶試劑盒說明書體系，PCR反應(yīng)體系如下:10 ×Buffer 2.5 μL，Dntp 0.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，PFU 0.3 μL，cDNA 1 μL，水 18.7 μL。反應(yīng)條件:95℃ 10 min，40循環(huán)(95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)最后72℃延伸5 min。結(jié)果取5 μL產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析檢測。

表1 RT-PCR所用引物序列及產(chǎn)物Tab.1 The primer sequences and product

6)PAS染色法檢測誘導(dǎo)細(xì)胞的糖原合成情況:采用PAS染色法檢測肝臟樣細(xì)胞糖原合成功能，具體如下:將制備的爬片用高碘酸氧化10 min;PBS清洗2次，5 min;Schiff試劑染15 min，避光反應(yīng);水洗;蘇木素復(fù)染，鏡下觀察。

7)細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法:10%的中性甲醛于室溫下固定15 min，0.25%的TritonX-100打孔液于室溫下通透，PBS清洗3次;然后用10%NGS封閉2 h，滴加第一抗體，4℃冰箱過夜。自冰箱中取出濕盒，室溫放置30 min，PBS清洗3次;滴加相應(yīng)2抗，DAB(1∶20)顯色，適時終止，蘇木素復(fù)染，鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)

新鮮分離的hADSCs呈較均一的圓形(圖1A);24 h后可見少量細(xì)胞貼壁(圖1B)，無明顯的形態(tài)變化;培養(yǎng)至第3天，可見紡錘狀細(xì)胞出現(xiàn)(圖1C);培養(yǎng)至第4、5、6天，可見紡錘狀細(xì)胞不斷增多(圖1D、E、F);培養(yǎng)至第7天，可見原代細(xì)胞生長融合達(dá)70%(圖1G);培養(yǎng)至第8天可見細(xì)胞整合達(dá)90%以上，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長，旋渦狀、輻射狀排列(圖1H)。

圖1 hADSCs細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.1 hADSCs cell morphology

2.2 細(xì)胞生長曲線

細(xì)胞在前2天生長較緩慢，第3天時細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，第6天細(xì)胞進(jìn)入生長平臺期，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量未增加，生長呈停滯狀態(tài)，細(xì)胞計數(shù)單位為103個/cm2(圖2)。

圖2 hADSCs生長曲線圖Fig.2 hADSCs growth curves

2.3 細(xì)胞表面抗原測定

流式細(xì)胞儀檢測第5代 hADSCs表面抗原，99.7%的細(xì)胞表達(dá)CD13，99.9%的細(xì)胞表達(dá)CD73，兩個干細(xì)胞表面抗原呈高表達(dá)狀態(tài);而僅有4.0%的細(xì)胞表達(dá)CD34，0.1%的細(xì)胞表達(dá)CD45，0.2%的細(xì)胞表達(dá)HLA-DR(圖3)。

2.4 細(xì)胞多向分化潛能測定結(jié)果

成脂誘導(dǎo)至第3周，絕大部分實驗組細(xì)胞質(zhì)被脂滴充滿，脂滴經(jīng)油紅O染色后呈鮮紅色(圖4A)，而對照組無陽性表達(dá)(圖4B);成骨誘導(dǎo)2周，可類似鈣結(jié)節(jié)的物質(zhì)出現(xiàn)，ALP染色，實驗組細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黑色顆粒(圖4C)，而對照組無黑色顆粒出現(xiàn)(圖4D)。

2.5 誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

實驗組細(xì)胞在誘導(dǎo)前呈長梭形、成纖維細(xì)胞樣生長，第一階段誘導(dǎo)至第2天，細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)改變(圖5A);第一階段誘導(dǎo)至第3天時，部分細(xì)胞逐漸由長梭形變成長橢圓形、類圓形及多角形(圖5B)，第二階段誘導(dǎo)至第6、10、13天時，向類圓形細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞逐漸增加，呈肝臟樣細(xì)胞生長(圖5C、D、E)，而對照組細(xì)胞仍保持成纖維細(xì)胞的形態(tài)，無形態(tài)變化(圖5F)。

圖3 hADSCs表面抗原表達(dá)情況Fig.3 hADSCs surface antigen expression

圖4 油紅O染色及ALP染色Fig.4 Oil red O staining and ALP staining(400 × )

圖5 誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察Fig.5 Induced cell morphology(400 × )

2.6 RT-PCR法檢測細(xì)胞的肝細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

第二階段誘導(dǎo)結(jié)束時，收集2組細(xì)胞RNA，RTPCR法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組肝臟樣細(xì)胞均檢測到AFP、ALB、CYP3A4肝細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，而未經(jīng)誘導(dǎo)的對照組細(xì)胞不表達(dá)AFP、CYP3A4，但表達(dá)ALB，不過表達(dá)強度要弱于實驗組(圖6)。

2.7 細(xì)胞免疫組織化學(xué)

HepPar-1抗體識別的抗原存在于正常人肝細(xì)胞和大多數(shù)的肝細(xì)胞癌中，絕大多數(shù)的肝細(xì)胞癌為陽性表達(dá)，是肝細(xì)胞相關(guān)的特異性抗體，也是現(xiàn)今病理科肝臟腫瘤鑒別與研究的重要指標(biāo)。甲胎蛋白AFP抗體用于檢測由肝細(xì)胞合成的糖蛋白抗體，可用于標(biāo)記肝癌細(xì)胞;角蛋白CK18、19抗體用于檢測腫瘤及細(xì)胞是否為上皮源性。這4個抗體的相關(guān)抗原，均存在于肝臟樣細(xì)胞的胞質(zhì)中。實驗組細(xì)胞經(jīng)第二階段誘導(dǎo)至第13天時，經(jīng)細(xì)胞免疫組化法檢測可見胞質(zhì)中有HepPar-1、AFP、CK18、CK19 抗體表達(dá)(圖 7A、B、C、D)，與陽性對照組的肝癌細(xì)胞表達(dá)一致(圖7E、F、G、H)，但陰性對照組細(xì)胞則為陰性表達(dá)(圖 7I、J、K、L)。

圖6 實驗組(1)和對照組(2)肝細(xì)胞標(biāo)志物(AFP、ALB、CYP3A4)的 mRNA 表達(dá)Fig.6 The mRNA expression of liver cell markers(AFP，ALB，CYP3A4)of the experimental group(1)and the control group(2)

圖7 細(xì)胞免疫組織化學(xué)示肝細(xì)胞相關(guān)抗原表達(dá)情況Fig.7 The liver-associated antigen expression detected by cell immunohistochemistry(200 × )

2.8 PAS染色法檢測肝臟樣細(xì)胞的糖原合成功能

取誘導(dǎo)結(jié)束細(xì)胞，行PAS染色，可見細(xì)胞質(zhì)被染成紅色，胞核為藍(lán)色(圖8A)，誘導(dǎo)后的肝臟樣細(xì)胞生成了糖原類的物質(zhì)，而對照組細(xì)胞則呈陰性表達(dá)(圖8B)。

圖8 PAS染色檢測細(xì)胞的糖原合成功能Fig.8 The glycogen synthesis by capacity detected by PAS staining(200×)

3 討論

目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)［2］報道可獲得具有肝臟功能的細(xì)胞的途徑主要有:①肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)［22］;②胚胎、臍血干細(xì)胞體外誘導(dǎo)［23-24］;③IPS(induced pluripotent stem cell)細(xì)胞體外誘導(dǎo)［25］;④成體干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)［26-29］。然而，上述幾種途徑既能避免倫理限制、又能通過體外大量擴(kuò)增獲得安全性高的肝臟樣細(xì)胞的方法只有通過成體干細(xì)胞體外誘導(dǎo)。近年來，大量文獻(xiàn)［30-35］報道了不同組織來源的成體干細(xì)胞體外均能被誘導(dǎo)成肝臟樣細(xì)胞，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)、外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)、脂肪干細(xì)胞(adipose tissue derived stem cells，ADSCs)、肝臟原位干細(xì)胞(HSL)等。目前僅有少數(shù)文獻(xiàn)［36-38］報道了脂肪來源干細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)成肝臟樣細(xì)胞。

2001年，Zuk等［14］發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中含有一種與BMSCs來源于同一胚層的，具有相近生物學(xué)性質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以發(fā)育成正常的軟骨和肌肉細(xì)胞等，并將這種細(xì)胞稱為脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue derived stem cells，ADSCs)。與其他成體干細(xì)胞相比，ADSCs取材容易，損傷小，可多次抽取;細(xì)胞數(shù)量多，體外增生速度快，且具有穩(wěn)定的倍增能力、低水平衰老。目前獲得hADSCs方法主要采用Ⅰ型膠原酶密度梯度離心法。本研究參考上述試驗方法，將脂肪組織與含有1 mg/mLⅠ型膠原酶PBS混合后，在室溫下，置于搖床上持續(xù)輕輕搖晃2～3 h，而并非于37℃下?lián)u晃1 h;離心后得到大量成纖維樣細(xì)胞。結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)量并無明顯減少，而且體外培養(yǎng)顯示細(xì)胞生長良好，很大程度上降低了分離hADSCs的試驗要求，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。

在肝臟再生過程中起重要作用的細(xì)胞因子很多，目前應(yīng)用最廣泛的是 HGF［39-40］和 FGF-4［9，20］。HGF主要在肝臟枯否細(xì)胞(Kupffer)與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生。當(dāng)其濃度小至1 ng/mL時，對肝細(xì)胞就有促進(jìn)有絲分裂作用，是正常肝細(xì)胞最強的促有絲分裂劑;它的另一重要作用就是能增加細(xì)胞的能動性［20］。Wang等［41］、張剛慶等［42］分別用 HGF 誘導(dǎo)大鼠骨髓 MSC，分化，均證明較高濃度HGF可誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞。Schwartz等［43］觀察了許多細(xì)胞因子(包括 aFGF、bFGF、FGF-4、HGF、FGF-7和OSM等)，發(fā)現(xiàn)只有FGF-4和HGF能誘導(dǎo)骨髓來源干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，認(rèn)為FGF-4也許在內(nèi)皮特化方面起重要作用，而HGF則能誘導(dǎo)非活躍增生狀態(tài)的肝細(xì)胞分化，通過二者的共同調(diào)控，HMSC的分化被激活從而分化為肝臟樣細(xì)胞。本研究采用二階段培養(yǎng)法，采用 HGF、FGF-4作為誘導(dǎo)劑，聯(lián)合應(yīng)用 EGF、OSM、DMSO等因子，促脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在體外向肝臟樣細(xì)胞分化，在誘導(dǎo)第3天時，部分細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變，由長的梭形生長成為類圓形或多角形;在誘導(dǎo)至第13天時，類圓形細(xì)胞進(jìn)一步增多，經(jīng)鑒定誘導(dǎo)的細(xì)胞具有肝臟樣細(xì)胞的功能。

本研究找到了一種經(jīng)濟(jì)簡便的實驗室分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的方法，為以后探索hADSCs的大量培養(yǎng)、純化的最佳條件和定向分化誘導(dǎo)提供實驗基礎(chǔ)。盡管對誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞的功能尚需進(jìn)一步檢測，但從本研究的實驗結(jié)果，筆者初步認(rèn)定ADSCs具有向肝臟樣細(xì)胞分化的能力。ADSCs體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化的成功，可以通過體外單純的培養(yǎng)環(huán)境，研究肝臟干細(xì)胞分化過程的調(diào)控機(jī)制，認(rèn)識其發(fā)生發(fā)育規(guī)律，為肝病的細(xì)胞治療提供細(xì)胞來源。本課題通過Ⅰ型膠原酶密度梯度離心法從脂肪組織中分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，研究其形態(tài)特點、表面標(biāo)志及多向分化潛能，并研究誘導(dǎo)成功的肝臟樣細(xì)胞的生物學(xué)功能及表面標(biāo)志。有望為生物性人工肝及肝組織工程提供種子細(xì)胞，為以細(xì)胞治療為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)提供理想的干細(xì)胞來源，進(jìn)而為終末期肝病及急性肝衰竭患者的治療帶來新希望。

［1］ Liu J，F(xiàn)an D.Hepatitis B in China［J］.Lancet，2007，369(9573):1582-1583.

［2］ Dhawan A，Puppi J，Hughes R D，et al.Human hepatocyte transplantation:current experience and future［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2010，7(5):288-298.

［3］ Okura H，Komoda H，Saga A，et al.Properties of hepatocyte-like cell clusters from human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells［J］.Tissue Eng Part C Methods，2010，16(4):761-770.

［4］ Zaret KS，Grompe M.Generation and regeneration of cells of the liver and pancreas［J］.Science，2008，322(5907):1490-1494.

［5］ Terry C，Hughes R D，Mitry R R，et al. Cryopreservationinduced nonattachment of human hepatocytes: role of adhesionmolecules［J］. Cell Transplant， 2007， 16( 6) : 639-647.

［6］ Thomson J A，Itskovitz-Eldor J，Shapiro S S，et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts［J］.Science，1998，282(5391):1145-1147.

［7］ Gallicano G I，Mishra L.Hepatocytes from induced pluripotent stem cells:a giant leap forward for hepatology［J］.Hepatology，2010，51(1):20-22.

［8］ Lee K D，Kuo T K，WhangPeng J，et al.In vitro hepatic differentiation of human mesench-ymal stem cells［J］.Hepatology，2004，40(6):1275-1284.

［9］ Snykers S，Vanhaecke T，Papeleu P，et al.Sequential exposure to cytokines reflecting-embryogenesis:the key for in vitro differentiation of adult bone marrow stem cells into functional hepatocyte-like cells［J］.Toxicol Sci，2006，94(2):330-341，discussion:235-339.

［10］ Lee M J，Jung J，Na K H，et al.Anti-fibrotic effect of chorionic plate-derived mesenchymal stem cells isolated from human placenta in a rat model of CCl(4)-injured liver:potential application to the treatment of hepatic diseases［J］.J Cell Biochem，2010，111(6):1453-1463.

［11］ Shin K S，Lee H J，Jung J，et al.Culture and in vitro hepatogenic differentiation of placenta-derived stem cells，using placental extract as an alternative to serum［J］.Cell Prolif，2010，43(5):435-444.

［12］ Lagasse E，Connors H，Al-Dhalimy M，et al.Purified hematopoietic stem cellscandifferentiate into hepatocytes in vivo［J］.Nat Med，2000，6(11):1229-1234.

［13］ Zuk P A，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies［J］.Tissue Eng，2001，7(2):211-228.

［14］Zuk P A，Zhu M，Ashjian P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］.Mol Biol Cell，2002，13(12):4279-4295.

［15］ di Bonzo L V，F(xiàn)errero I，Cravanzola C，et al.Human mesenchymal stem cells as a twoedged sword in hepatic regenerative medicine:engraftment and hepatocyte differentiation versus profibrogenic potential［J］.Gut，2008，57(2):223-231.

［16］ Chen Y，Dong X J，Zhang G R，et al.In vitro differentiation of mouse bone marrow stromal stem cells into hepatocytes induced by conditioned culture medium of hepatocytes［J］.J Cell Biochem，2007，102(1):52-63.

［17］ Matsunaga T，Sakamaki S，Kohgo Y，et al.Recombinant human granulocyte Colony-stimulating factor can mobilize sufficient amounts of peripheral blood stem cells in healthy volunteers for allogeneic transplantation［J］.Bone Marrow Transplant，1993，11(2):103-108.

［18］Kasai M，Kiyama Y，Kawamura A.Application of peripheral blood stem cells(PBSC)mobilized by recombinant human granulocyte colony stimulating factor for allogeneic PBSC transplantation and the comparison of allogeneic PBSC transplantation and bone marrow transplantation［J］.Transfus Apher Sci，2002，26(2):121-127.

［19］ Conget P A，Min guell J J.Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells［J］.J Cell Physiol，1999，181(1):67-73.

［20］ Seo M J，Suh S Y，Bae Y C，et al.Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo.Biochem［J］.Biophys Res Commun，2005，328:258-264.

［21］Safford K M，Hicok K C，Safford S D，et al.Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells［J］.BiochemBiophys Res Commun，2002，294:371-379.

［22］Lee R H，Kim B，Choi Iet al.Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone mar-row and adipose tissue［J］.Cell Physiol Biochem，2004，14(4-6):311-324.

［23］ Katz A J，Tholpady A，Tholpady S S，et al.Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal(hADAS)cells［J］.Stem Cells，2005，23(3):412-423.

［24］Gronthos S，F(xiàn)ranklin D M，Leddy H A，et al.Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells［J］.J Cell Physiol，2001，189(1):54-63.

［25］Kern S，Eichler H，Stoeve J，et al.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow，umbilical cord blood or adi-pose tissue［J］.Stem Cells，2006，24(5):1294-1301.

［26］Strem B M，Hicok K C，Zhu M，et al.Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells［J］.Keio J Med，2005，54(3):132-141.

［27］ Dicker A，Le Blanc K，Astrom G，et al.Functional studies of mesenchymal stem cells derived from adult human adipose tissue［J］.Exp Cell Res，2005，308(2):283-290.

［28］ Im G I，Shin Y W，Lee K B.Do adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as bone marrow-derived cells?［J］.Osteoarthritis Cartilage，2005，13(10):845-853.

［29］Safford K M，Hicok K C，Safford S D，et al.Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells［J］.BiochemBiophys Res Commun，2002，294(2):371-379.

［30］Secco M，Moreira Y B，Zucconi E，et al.Gene expression profile of mesenchymal stem cells from paired umbilical cord units:cord is different from blood［J］.Stem Cell Rev，2009，5(4):387-401.

［31］王曉輝，惠玲，楊霄鵬，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)、鑒定及其誘導(dǎo)分化的研究［J］.解放軍醫(yī)藥雜志，2013，25(10):11-15，30.

［32］Ruhnke M，Ungefroren H，Nussler A，et al.Differentiation of in vitro modified human peripheral blood monocytes into hepatocytelike and pancreatic isletlike cells［J］.Gastroenterology，2005，128(7):1774-1786.

［33］ Izadpanah R，Trygg C，Patel B，et al.Biologic properties of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and adipose tissue［J］.J Cell Biochem，2005，99(5):1285-1297.

［34］ He Z，F(xiàn)eng M.Activation，isolation，identification and culture of hepatic stem cells from porcine liver tissues［J］.Cell Prolif，2011，44(6):558-566.

［35］ Yan L，Han Y，Wang J，et al.Peripheral blood monocytes from patients with HBV related decompensated liver cirrhosis can differentiate into functional hepatocytes［J］.Am J Hematol，2007，82(11):949-954.

［36］尹鵬，梁慶威.外源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白7聯(lián)合血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的實驗研究［J］. 中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，(10):897-901.

［37］Banas A，Teratani T，Yamamoto Y，et al.Adipose tissuederived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes［J］.Hepatology，2007，46(1):219-228.

［38］Aurich H，Sgodda M，Kaltwasser P，et al.Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells from human adipose tissue in vitro promotes hepatic integration in vivo［J］.Gut，2009，58(4):570-581.

［39］Fiegel H C，Lioznov M V，Cortes-Dericks L，et al.Liver-Specific gene expression in cultured human hematopoietic stem cells［J］.Stem Cells，2003，21(1):98-104.

［40］Takeda M，Yamamoto M，Isoda K，et al.Availability of bone marrow stromal cells in three-dimensional coculture with hepatocytes and transplantation into liver damaged mice［J］.J Biosci Bioeng，2005，100(1):77-81.

［41］ Wang P P，Wang J H，Yan Z P，et al.Expression of hepatocyte-like phenotypes in bone marrow stromal cells after HGF induction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，320(3):712-716.

［42］張剛慶，方馳華，池達(dá)智.肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的實驗研究［J］.中華外科雜志，2005，43(11):716-720.

［43］Schwartz R E，Reyes M，Koodie L，et al.Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells［J］.J Clin Invest，2002，109(10):1291-1302.