王 鵬 李 昕 陳予東 楊巍巍 李旭冉 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京100053;2北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林吉林132013)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是臨床上最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，表現(xiàn)呈進(jìn)展性，目前臨床上尚無(wú)控制病程發(fā)展的有效措施，因此揭示這一疾病的機(jī)制，采取早期診斷并預(yù)防顯得日益迫切。PD的病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生變性壞死，以及路易小體(Lewy body)和路易軸索(Lewy neurite)的形成［1-2］。Lewy body和Lewy neurite是纖維淀粉樣變的嗜酸性包涵體。人α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是參與形成淀粉樣變性的主要成分。已知，LB的主要成分是聚集的α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)［3-6］，聚集成寡聚體的 α-Syn對(duì)神經(jīng)元具有毒性作用［7-8］。α-Syn 主要分布于突觸前膜和核膜［9-11］，與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，參與突觸形成、維持和神經(jīng)元的分化。近來(lái)研究［12］表明α-Syn與微管蛋白互為分子伴侶，通過(guò)促進(jìn)微管蛋白的聚合，α-Syn能夠加速微管的形成。本課題組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)α-Syn可以促進(jìn)原代培養(yǎng)的大鼠原代神經(jīng)元和MES23.5細(xì)胞的突起生長(zhǎng)［13］，該功能片段位于蛋白的NAC段和C端，其家族型突變體A53T、A30P沒(méi)有突起促生長(zhǎng)功能［14］。這些發(fā)現(xiàn)提示α-Syn的突起促生長(zhǎng)功能改變及其潛在的對(duì)突觸可塑性影響可能是PD發(fā)病早期的重要線索。本研究的目的是探討α-Syn的寡聚體對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的影響，為揭示PD發(fā)病中Lewy小體形成及其發(fā)病機(jī)制提供線索。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，購(gòu)自Pierce Biotech公司;α-Syn單克隆抗體3D5，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物研究室制備;FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體，購(gòu)自中衫金橋公司;細(xì)胞培養(yǎng)基neurobasal和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自美國(guó)Pharmacia公司。其他均為化學(xué)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生24 h Wistar大鼠32只，雌雄不限，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK-(軍)2002-001］。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 α-Syn重組蛋白的制備與純化

將人α-Syn cDNA分別插入表達(dá)載體pET(3a)，然后轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐西林的YTA培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。所表達(dá)的基因重組型蛋白采用離子交換層析和反向?qū)游龇兓?。將純化后的蛋白透析，分裝，冷凍抽干。純化后的蛋白用SDS-PAGE法和Western blotting法鑒定，BCA法定量。

1.3.2 α-Syn寡聚體標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將α-Syn凍干粉末用PBS溶解使其終質(zhì)量濃度為100 μmol/L，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，在37 ℃下650 r/min恒溫振蕩72 h。

1.3.3 α-Syn寡聚體的測(cè)定

參照作者實(shí)驗(yàn)室已建立的方法［15］進(jìn)行測(cè)試。用濃度為1 mg/L 3D5包被96孔酶標(biāo)板，2.5% 明膠封閉2 h。加入寡聚體樣品，37℃孵育2 h，再加入終濃度為1 mg/L生物素標(biāo)記3D5抗體，37℃孵育2 h。洗板后向各孔加入1/5 000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素，37℃孵育后以對(duì)硝基酚磷酸(Disodium 4-nitrophenyl phosphate，pNPP)顯色液顯色，于波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定吸光度值。

1.3.4 原代神經(jīng)元培養(yǎng)

將新生24 h大鼠斷頭取腦，置于D-Hank's緩沖液。剝?nèi)パ苣X膜，分離皮質(zhì)，剪碎。胰酶消化30 min后吹散，200目篩網(wǎng)過(guò)濾。800 r/min離心2 min。棄上清，沉淀以DMEM培養(yǎng)基懸浮并計(jì)數(shù)細(xì)胞。以0.75×105個(gè)/皿接種在用多聚賴(lài)氨酸包被好的培養(yǎng)皿(φ35 mm)中，加入相應(yīng)蛋白進(jìn)行分組培養(yǎng)。

1.3.5 神經(jīng)元突起生長(zhǎng)觀察和長(zhǎng)度測(cè)量

培養(yǎng)至第1、2和4小時(shí)，以多聚甲醛室溫下固定1 h。隨機(jī)挑選20個(gè)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野至少有5個(gè)存活的神經(jīng)元［16］。應(yīng)用Image-Pro Plus V2.0軟件測(cè)量神經(jīng)元突起的長(zhǎng)度。

1.3.6 Western blotting法和免疫熒光法鑒定轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)α-Syn寡聚體

吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗。刮下細(xì)胞，超聲破碎。功率200 W，30 s 2次，間歇30 s。破碎后的細(xì)胞溶液加入SDS-PAGE Running Buffer，沸水中煮5 min。離心并轉(zhuǎn)移上清，取30 μL作為樣品，進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)PVDF膜、封閉。沖洗后，以1/1 000比例稀釋的3D5抗體反應(yīng)過(guò)夜。洗膜，再與1/5 000稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液反應(yīng)。ECL法顯示條帶。

將培養(yǎng)細(xì)胞，以1%的戊二醛室溫下固定1 h后，PBS沖洗培養(yǎng)皿。以含10%羊血清的PBST溶液，室溫封閉1 h。棄封閉液，加入1/5 000稀釋的3D5抗體1.5 mL，4℃過(guò)夜。PBST沖洗后加入1/500稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠抗體，37℃，2 h;吸棄反應(yīng)液，PBST沖洗。熒光顯微鏡下觀察照相。

1.3.7 培養(yǎng)分組方案

向原代神經(jīng)元培養(yǎng)基中添加終濃度為10 μmol/L的α-Syn寡聚體，培養(yǎng)至第1、2、4小時(shí)觀察。分別添加終濃度為 1、5、10、15 和 20 μmol/L 的相應(yīng)蛋白，培養(yǎng)至4 h，觀察突起長(zhǎng)度變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件，數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。多組樣本均數(shù)比較采用析因方差分析法。兩變量的相關(guān)分析采用Bivariate過(guò)程的Pearson直線相關(guān)法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白純化鑒定結(jié)果

經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting法鑒定，獲取的α-Syn和寡聚體純度較高，根據(jù)分子量判斷圖1。

2.2 α-Syn寡聚體對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)有抑制作用

添加α-Syn寡聚體(10 μmol/L)以及其他蛋白進(jìn)行分組培養(yǎng)。經(jīng)觀察，在神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)早期，各組間細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量并無(wú)差異。細(xì)胞培養(yǎng)至1、2 h，添加α-Syn寡聚體組的神經(jīng)元突起平均長(zhǎng)度小于對(duì)照組(P＜0.05)。培養(yǎng)至4 h，α-Syn寡聚體組神經(jīng)元突起長(zhǎng)度明顯小于對(duì)照組(P＜0.01)，詳見(jiàn)圖2。添加不同濃度(1～20 μmol/L)的各蛋白，培養(yǎng)至4 h觀察，α-Syn寡聚體組突起長(zhǎng)度隨寡聚體濃度的增加而生長(zhǎng)的趨勢(shì)減小，對(duì)照組則無(wú)變化，詳見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)α-Syn寡聚體可以抑制神經(jīng)元突起生長(zhǎng)。

圖1 α-Syn的純化及鑒定Fig.1 Puritication and identification of α-Syn

圖2 α-Syn寡聚體對(duì)神經(jīng)元突起早期生長(zhǎng)的影響Fig.2 The α-Syn oligomer inhibits on the neurite outgrowth

圖3 α-Syn寡聚體對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的抑制作用具有劑量效應(yīng)關(guān)系Fig 3.The effect of α-Syn oligomer inhibit on the neurite outgrowth appeared dose-effect dependent relation

2.3 α-Syn寡聚體可以從培養(yǎng)基進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)

添加α-Syn寡聚體組神經(jīng)細(xì)胞裂解液Western blotting法檢測(cè)結(jié)果現(xiàn)清晰條帶，對(duì)照組為陰性，圖4A。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示神經(jīng)元顯色清晰，在胞漿內(nèi)廣泛分布并呈現(xiàn)顆粒狀，α-Syn組在胞質(zhì)內(nèi)均勻分布，而對(duì)照組為陰性，見(jiàn)圖4B?？梢?jiàn)α-Syn寡聚體可以從培養(yǎng)基進(jìn)入神經(jīng)元并影響突起生長(zhǎng)。

3 討論

圖4 α-Syn寡聚體向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)Fig.4 Transportation of α-Syn oligomer into primarily cultured neurons

在原代神經(jīng)元生長(zhǎng)初期，微管(microtubule)在神經(jīng)細(xì)胞的突起中起細(xì)胞骨架的作用，輔助突起發(fā)育。在成熟的神經(jīng)元中，微管是物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐緩?，參與神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。體外研究［17］證明，α-Syn具有與tau蛋白相似的作用，可以促進(jìn)微管蛋白組裝成微管。本課題組前期研究［18-20］發(fā)現(xiàn)通過(guò)促進(jìn)微管的組裝，α-Syn可以促進(jìn)大鼠原代神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，這一作用提示該蛋白很可能參與神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育階段神經(jīng)元突起的形成以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)。而在帕金森病的發(fā)病過(guò)程中，α-Syn異常聚集形成寡聚體。患者血液、腦脊液中亦可檢測(cè)到主要成分為聚集的α-Syn的Lewy小體，由此可知致PD患者神經(jīng)元死亡的內(nèi)環(huán)境紊亂可能是由于α-Syn寡聚體的存在。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)α-Syn的寡聚體可以進(jìn)入原代神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，并抑制突起的早期生長(zhǎng)。這一結(jié)果的原因可能由于伴侶蛋白的異常聚集或寡聚體的直接干擾，影響微管的合成和有序排列，致使神經(jīng)元突起修復(fù)和重建障礙或軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)無(wú)定形物的形成聚集。促微管聚合的作用的喪失，可能影響神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)，對(duì)揭示α-Syn突變導(dǎo)致神經(jīng)元退變的機(jī)制也有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，在原代神經(jīng)元培養(yǎng)早期，外源性的α-Syn寡聚體可抑制突起生長(zhǎng)。Sung等［21］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)α-Syn抑制H19-7大鼠海馬神經(jīng)祖細(xì)胞的增生。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示添加α-Syn寡聚體組細(xì)胞內(nèi)蛋白免疫反應(yīng)呈陽(yáng)性，進(jìn)入細(xì)胞的寡聚體以二聚體和三聚體為主，對(duì)照組為陰性。免疫熒光印跡結(jié)果顯示，α-Syn組和寡聚體組在神經(jīng)元內(nèi)呈現(xiàn)輪廓清晰的綠色熒光，證明外源性的α-Syn和寡聚體在胞體和突起均有分布。外源性α-Syn進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)，分布均勻。這與微管在細(xì)胞內(nèi)的分布一致，提示進(jìn)入細(xì)胞的α-Syn與微管蛋白之間存在伴侶關(guān)系。而寡聚體則呈現(xiàn)顆粒狀分布，可能與其抑制微管蛋白聚合形成微管這一作用有關(guān)［22］。雖然α-Syn寡聚體的細(xì)胞毒性已作為PD研究的熱點(diǎn)多時(shí)，但寡聚體的形成原因與機(jī)制仍未完全明確。本研究從α-Syn寡聚體與微管蛋白之間的共同作用關(guān)系入手，成為解釋PD病因的新的觀點(diǎn)。此研究結(jié)果為揭示α-Syn的功能，及其與微管蛋白的關(guān)系提供了新證據(jù)，對(duì)PD的病因、病機(jī)闡述提供了新思路。

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