唐吉旺，周 叢，林 源，肖 泳，鐘文濤，吳海智

（湖南省產(chǎn)品商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

氯霉素是一種廣譜性抗生素，在所有成年動(dòng)物中作為獸藥被長(zhǎng)期使用.獸醫(yī)臨床上用于治療畜禽的細(xì)菌性疾病.食品中氯霉素殘留對(duì)人類的健康構(gòu)成直接或潛在的威脅，特別是氯霉素能導(dǎo)致人類的再生性障礙性貧血，是一種可能的致癌物質(zhì)，并且其致癌效果與劑量大小無(wú)關(guān).因此，歐盟、美國(guó)、加拿大規(guī)定氯霉素嚴(yán)格禁止在食用動(dòng)物中使用，同時(shí)歐盟實(shí)施愈來(lái)愈嚴(yán)格的計(jì)劃監(jiān)控，規(guī)定氯霉素在肉、海鮮、雞蛋、牛奶、蜂蜜等食用動(dòng)物內(nèi)的最小執(zhí)行限量（MRPL）為0.3μg/kg.因此，尋求快速、靈敏檢測(cè)技術(shù)，降低方法的檢出限成為氯霉素殘留檢測(cè)技術(shù)研究焦點(diǎn)［1-4］.

由于樣品本身具有復(fù)雜的基質(zhì)，再加上最低檢測(cè)限量（＜0.3μg/kg）和檢測(cè)方法可行性這雙重嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，氯霉素食物殘留分析具有很大的挑戰(zhàn)性.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，推進(jìn)了液相色譜的發(fā)展，其具有特異性和靈敏性，非常適合食物中氯霉素殘留的分析.LC-MS/MS運(yùn)行之前需進(jìn)行樣品制備和前處理.而傳統(tǒng)的前處理過(guò)程中用到固相萃?。⊿PE）和液-液萃?。↙LE）技術(shù)［5-7］，樣品前處理比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，同時(shí)增加了檢測(cè)成本.本文作者介紹一種簡(jiǎn)單樣品制備方法，該方法僅僅使用乙腈進(jìn)行氯霉素的提取，同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，將沉淀物分離后即可進(jìn)行高效液相分離和三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀的檢測(cè).此樣品前處理方法簡(jiǎn)單、快速、費(fèi)用低，同時(shí)滿足定性分析特異性需求和定量分析的靈敏度要求.其有效性也符合歐盟規(guī)定2002/657/EC.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（TSQ Quantum Ultra Thermo Fisher Scientific），配有電噴霧離子源；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Neofuge 23R，上海力申科學(xué)儀器有限公司）；10mL聚四氟乙烯離心管；超聲儀（SB-5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）.

氯霉素（CAP）：純度≥99.0%；氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（CAP-D5）：純度≥99.9%；乙腈，液相色譜純.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10.0mg氯霉素和氯霉素-D5，用乙腈定容至100mL，配制成100.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)根據(jù)需要用水稀釋成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確秤取2.0g液體乳制品或1.0g固體乳粉（固體乳粉在處理前需加2mL的40～60℃的熱水將其溶解），加入400μL濃度為100μg/L的氯霉素-D5溶液，渦旋混勻，再加入3mL乙腈，渦旋振蕩提取1～2 min后，于超聲儀中超聲30min.超聲提取后，4℃條件下以6 000r/min冷凍離心10min.取上清液0.75 mL，加入0.25mL水，渦旋混勻，并于4℃冰箱中儲(chǔ)存1h.再以6 000r/min冷凍離心10min.取上清液，用0.22μm的有機(jī)膜過(guò)濾，然后進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定.

1.4 HPLC-MS/MS條件

1.4.1 HPLC條件

色譜柱：Hypersil GOLDTM柱（100mm×3mm，1.9μm）；流動(dòng)相：溶劑A為水，溶劑B為甲醇；梯度洗脫程序：0～0.5min，80%A，0.5～3.5min，80%A～5%A，3.5～3.9min，5%A，3.9～4.0min，5%A～80%A，4～5.0min，80%A.流速為0.5mL/min，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μL.

1.4.2 MS/MS條件

離子源為電噴霧電離離子源（ESI），掃描方式為負(fù)離子掃描，輔助氣壓力為10Arb，鞘氣壓力為45Arb，離子噴霧電壓（IS）為2 800V，霧化器溫度為300℃，離子源溫度為350℃，碰撞氣（氬氣）壓力為1.5mtorr，檢測(cè)方式為選擇離子監(jiān)測(cè)（SRM）掃描模式.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于乳制品樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有較高濃度的蛋白質(zhì)及大量的內(nèi)源性化合物，干擾目標(biāo)物的測(cè)定，因此必須盡量去除蛋白質(zhì)，減少基質(zhì)對(duì)測(cè)試的影響.此實(shí)驗(yàn)方法的主要目的就是為了避免使用許多文獻(xiàn)中提到的費(fèi)時(shí)費(fèi)力的固相萃?。⊿PE）或是液-液萃取（LLE）制備方法.氯霉素易溶于乙腈，因此選用乙腈作為提取溶劑，可以對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行有效的提取，同時(shí)乙腈又能較好地沉淀蛋白質(zhì).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙腈與樣品溶液的體積比為1.5∶1時(shí)，能滿足提取效率的要求，達(dá)到富集的目的，同時(shí)能初步沉淀蛋白質(zhì).取部分乙腈提取液，按照一定的比例加水稀釋，這步操作對(duì)梯度色譜分離來(lái)說(shuō)是非常必要的.實(shí)驗(yàn)表明，乙腈提取液和水的比例為3∶1時(shí)，蛋白質(zhì)沉淀效果比較好，但是蛋白質(zhì)的清除是不徹底的.當(dāng)在4℃的冰箱中放置1h后，試管底部出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀的痕跡，因此這步操作可以防止未沉淀徹底的蛋白質(zhì)進(jìn)入儀器，干擾分析，污染儀器.

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了甲醇-水和乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)于目標(biāo)化合物峰型和離子化效率的影響.結(jié)果表明用甲醇-水溶液作流動(dòng)相，在梯度洗脫條件下，HPLC-MS/MS分析的色譜峰分離度較好，峰形好且響應(yīng)高.因乳制品內(nèi)源性干擾較多，不宜選用過(guò)短的色譜柱，兼顧分析耗時(shí)選擇色譜柱長(zhǎng)為100mm較為合適.

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI負(fù)離子掃描模式下，對(duì)1mg/L的氯霉素和氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描.結(jié)果表明，這兩種化合物的最強(qiáng)峰均為其準(zhǔn)分子離子峰，因此選擇分子離子［M-H］-為母離子.然后分別對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行子離子掃描，得到碎片的離子信息，找到強(qiáng)度較大的三個(gè)子離子，并優(yōu)化碰撞能量使其強(qiáng)度最大，將其中一個(gè)信號(hào)大的子離子作為定量離子，由此得到氯霉素和氯霉素-D5在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1.所測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液中氯霉素及其同位素內(nèi)標(biāo)氯霉素-D5的SRM色譜圖見(jiàn)圖1.

圖1 氯霉素和氯霉素-D5的SRM色譜圖Fig.1 SRM chromatograms of CAP and CAP-D5

表1 氯霉素和氯霉素-D5質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 MS/MS acquisition parameters for CAP and CAP-D5

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢出限

本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量.在上述最佳色譜條件下，檢測(cè)濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，以各濃度峰面積Y對(duì)相應(yīng)濃度X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到氯霉素的線性回歸方程為Y＝0.010 64 X＋0.000 673 2，其相關(guān)系數(shù)R為0.999 8；以信噪比S/N＝3計(jì)算出樣品中氯霉素的檢出限LOD值為0.1μg/kg.結(jié)果表明在0.10～10.0μg/L范圍內(nèi)，濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系.

2.5 方法的回收率和精密度

分別準(zhǔn)確稱取空白液體乳樣品或奶粉樣品，并分別添加3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.2、2.0和10.0μg/L，按照前述步驟進(jìn)行氯霉素的提取、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次.加標(biāo)樣品的SRM色譜圖見(jiàn)圖2.平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見(jiàn)表2.結(jié)果表明，氯霉素在液體乳基質(zhì)中的回收率在95.0%～102.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.86%～5.35%之間；氯霉素在奶粉基質(zhì)中的回收率在90.0%～101.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.16%～5.64%之間.

圖2 乳制品空白及空白加標(biāo)（加標(biāo)量為2.0μg/L）SRM圖Fig.2 SRM chromatograms of CAP in blank sample and blank samle spiked with 2.0μg/L of CAP

表2 氯霉素在液體乳和奶粉中的加標(biāo)回收率及其精密度（n＝6）Table 2 Recoveries and precisions of CAP spiked in liquid milk and powdered milk（n＝6）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

分別對(duì)湖南、貴州及武漢三個(gè)省份奶制品中的氯霉素進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，共計(jì)65個(gè)樣品，其中奶粉為18個(gè)樣，其余均為液體乳及其制品，監(jiān)測(cè)結(jié)果為均未檢出氯霉素殘留.這表明目前乳制品奶源中的獸藥殘留得到了較好的控制.

結(jié)論：本文建立了同位素稀釋的HPLC-MS/MS法檢測(cè)乳制品氯霉素殘留的方法，樣品前處理簡(jiǎn)捷方便、處理過(guò)程所用有機(jī)試劑少、可操作性強(qiáng)，分析成本低，分析效率高，便于大批量的樣品分析；同時(shí)，質(zhì)譜分析時(shí)間短，方法的檢測(cè)限低，準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)到了藥物殘留分析的要求，為監(jiān)測(cè)乳制品質(zhì)量安全提供了一種較好的檢測(cè)手段.

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