楊永霞，牛志強，張松濤，崔紅，劉國順

國家煙草栽培生理生化研究基地 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002

煙草類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因CCD1的克隆與表達(dá)分析

楊永霞，牛志強，張松濤，崔紅，劉國順

國家煙草栽培生理生化研究基地 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002

為深入探索CCD1 的功能，利用RACE方法獲得了煙草品種K326類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因CCD1的2個cDNA全長序列。序列分析表明，CCD1-1與CCD1-2各包含一個1635和1647bp的開放讀碼框(ORF)，編碼544和548個氨基酸。分別與林煙草和絨毛狀煙草CCD1存在一個堿基的差異。CCD1-1與CCD1-2基因序列GC含量為43.24%和42.87%。預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量均為61 kDa,理論等電點 (pI) 6.51和6.55。與番茄和辣椒等植物的類胡蘿卜素CCD1的同源性達(dá)到80%以上?？缒^(qū)預(yù)測表明分別在138～158和142～162位氨基酸間有1個跨膜螺旋區(qū)。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析表明，均以β折疊和無規(guī)則卷曲為主。蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明CCD1-1與CCD1-2空間結(jié)構(gòu)極為相似。組織表達(dá)分析表明，CCD1-1與CCD1-2在花中的表達(dá)最強，根中的表達(dá)最弱，莖和葉次之。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究類胡蘿卜素降解基因的功能提供了依據(jù)。

煙草；克?。活惡}卜素裂解雙氧合酶；序列分析

類胡蘿卜素在光合作用中擔(dān)負(fù)著光吸收輔助色素的重要功能，同時也是煙葉重要致香物質(zhì)的前體物，降解產(chǎn)物的種類及含量與煙葉香氣品質(zhì)有關(guān)[1]。尤其是茄酮和β-大馬酮等香味物質(zhì)是影響煙葉香氣質(zhì)和香氣量的重要組分[2]。雖然對類胡蘿卜素的降解仍有許多問題有待深入研究，但對模式植物擬南芥類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因的研究為研究煙草類胡蘿卜素降解提供了有益借鑒。已發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素裂解雙氧合酶（carotenoid cleavage dioxygenases,CCDs）可催化裂解很多類胡蘿卜素底物生成許多天然活性化合物（apocarotenoids），是類胡蘿卜素降解過程的關(guān)鍵酶[3-4]。擬南芥CCD基因家族包含9個成員。有 5 種與ABA的合成有關(guān)，命名為NCED(包括NCED2,3,5,6,9)[5]，其余 4 個被命名為CCD(包括CCD1,4,7,8)，與植物激素(如獨腳金內(nèi)酯)、側(cè)枝的生長和發(fā)育以及風(fēng)味芳香物的形成過程密切相關(guān)[6-9]。幾種CCD基因中，CCD1基因的作用機制最為復(fù)雜。在不同的植物中，CCD1編碼的酶具有底物降解偏好性和功能特異性，可降解不同類胡蘿卜素底物的不同雙鍵，產(chǎn)生不同碳原子數(shù)的化合物，形成許多重要的香氣物質(zhì)。關(guān)于不同植物CCD1的功能我們在以往的文章中已有詳細(xì)綜述[10]。目前，NCBI數(shù)據(jù)庫中除煙草Nicotiana langsdorf fii x Nicotiana sanderae雜交種CCD1的部分序列外，還沒有相關(guān)基因克隆的報道。鑒于此，本研究克隆了煙草K326CCD1基因的全長cDNA序列，并采用生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行了詳細(xì)分析，為進(jìn)一步研究CCD1的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

試驗所用材料為煙草品種K326、林煙草以及絨毛狀煙草。采用漂浮育苗法育苗，溫室培養(yǎng)至5-6片真葉幼苗，再移至含有基質(zhì)的花盆中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和試劑盒

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α 為本試驗室保存。pMD19-T 載體、普通Taq酶、高保真 LATaq酶、dNTP、Clontech的RACE試劑盒等試劑購自寶生物工程有限公司(TaKaRa)；Trizol 試劑購自 Invitrogen公司，DNA 凝膠純化回收試劑盒購于 omega 公司。M-MLV Revere Transcriptase (RNase H)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Marker DL2000購自上海萊楓生物科技有限公司。引物由Invitrogen 公司合成。

1.2 RNA提取及RACE模板制備

采用Trizol法提取RNA。將組織在液氮中磨成粉末，取適量的組織于離心管中，然后加入1mL Trizol提取液；室溫放置5分鐘，加入0.2mL氯仿，劇烈搖蕩離心管15秒。4℃，12000 g離心15 min；吸取上層水相，至另一離心管中。加入0.5mL異丙醇-20℃冰箱放置20 min；4℃，12000 g離心10 min，棄上清，RNA沉于管底；75%乙醇清洗沉淀2次。4℃ 8000 g離心5 min，棄盡上清；室溫晾干加入50 μL ddH2O溶解RNA樣品。運用Clontech的RACE試劑盒制備5’Race 和3’Race模板。

1.3 CCD1全長基因的克隆

參考GenBank收錄的煙草Nicotiana langsdorf fii x Nicotiana sanderae雜交種CCD1 基因序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計煙草K326 5’和3’擴增引物CCD-51 (5’-CATCTCCCTCCTCCCAAGCATT-3’)與CCD-31(5’-TGGGAGGAGGGAGATGATGTG-3’)，利 用 clonetech RACE kit 進(jìn) 行 5/3’RACE， 按 照說明書操作獲取基因的全長cDNA序列。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計跨起始密碼子和終止子的引物CCD-1F(5’-GAGACAGAGGTAAAATGGGGAG-3’) 和CCD-1R (5’-TCACAAGTATTTCTCACAGTTTG-3’)驗證CCD1全長序列，此引物同時對林煙草與絨毛狀煙草進(jìn)行擴增。

PCR 擴增產(chǎn)物采用 1% 瓊脂糖凝膠分離?；厥占兓筮B接到 pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,然后涂布于加有 X-gal 和 IPTG 的 LB 培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)過夜。挑取白斑,用 M13 引物擴增檢測。篩選出預(yù)期大小的陽性克隆送 Invitrogen 公司測序，每個片段至少測 3 個克隆。不同引物對擴增出的重疊區(qū)段用 DNAman 軟件進(jìn)行序列拼接。

1.4 序列分析

利用 NCBI 的 Blast和ORF finder進(jìn)行核酸序列比較與閱讀框架確定。運用 DNAstar 軟件推測蛋白質(zhì)序列，Expasy Protparam軟件[11]分析蛋白質(zhì)的分子量、等電點和氨基酸組成。PROSITE[12]和SMART[13]軟件預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域。蛋白質(zhì)疏水性分析、跨膜區(qū)預(yù)測和螺旋卷曲分析分別采用 ProtScale (http://www.expasy.ch/tools)、TMpred[14]和 Coils[15]軟件進(jìn)行。使用在線工具 SOPMA[16](http://www.expasy.org) 預(yù)測二級結(jié)構(gòu)并計算各種二級結(jié)構(gòu)所占的百分比。同時將推測的氨基酸序列提交瑞士生物信息研究所 (European Bioinformatics Institute:http://www.isb-sib.ch/) Swissmodel,基于同源建模的原理進(jìn)行蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。蛋白三維結(jié)構(gòu)用 PyMol 軟件顯示。

1.5 CCD1的表達(dá)分析

盛花期分別取煙草品種K326中部葉、根、莖以及花1.0 g，放入1.5mL的離心管中，立即放入液氮中速凍，置-80℃冰箱保存。按照Trizol法提取RNA，依照M-MLV Revere Transcriptase (RNase H)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA第一鏈。以煙草的CCD1-1和CCD1-2基因全長序列設(shè)計特異性正反向引物：CCD1-1F：5'-TGAAACTCCTCCTCTTACCAACCTC-3’CCD1-1R：5'-GTATTAGCTGCGCCATTTCCG-3’，CCD1-2F：5'-TGAAACTCCTCCTTTTAAGAAC-3’，CCD1-2R：5'-CGCATCTAGATCTGGATTCTGC-3’，以煙草根、莖、葉和花 cDNA 為模板擴增目的基因片段。PCR 程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 50 s，35個循環(huán)，72℃ 10 min。以煙草L25基因 (L18908) 作為 RT-PCR反應(yīng)的內(nèi)參基因，內(nèi)參引物 L25-F：GCTTTCTTCGTCCCATCA；L25-R：CCCCAAGTACCCTCGTAT，半定量 RT-PCR的反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s,46℃ 30 s,72℃ 50 s，30個循環(huán)，72℃10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCD1 cDNA和DNA全長序列的克隆和測序

采用TRIzol RNA提取方法，提取了K326、林煙草以及絨毛狀煙草的總RNA，獲得了28S和18S比例較好的RNA，運用Clontech的RACE試劑盒通過Race PCR方法擴增得到K326CCD1基因的5’端和3’端基因片段，其中5’端大小約800 bp左右，3’端大小約500 bp（圖1），試劑盒回收相應(yīng)片段，運用菌落PCR和質(zhì)粒PCR方法鑒定出陽性克隆，送生物公司測序。通過與5’和3’以及中間序列拼接，得到CCD1 cDNA全長序列。

圖1 CCD1 ORF擴增電泳檢測圖

利用引物CCD-1F和CCD-1R擴增K326、林煙草以及絨毛狀煙草的ORF，得到1700 bp左右的片段(圖1)，回收相應(yīng)片段測序，結(jié)果表明K326包含兩個CCD1 (CCD1-1與CCD1-2)基因序列(Genbank登錄號KC747729，KC747730)。序列分析表明林煙草只含有CCD1-1(Genbank 登錄號KC747731)，而絨毛狀煙草只含有CCD1-2(Genbank 登錄號KC747732)。

2.2 CCD1基因和蛋白序列的分析

2.2.1 序列分析

對K326CCD1 cDNA全長序列進(jìn)行ORF finder分析發(fā)現(xiàn)，CCD1-1型基因包含一個1635 bp的完整開放讀碼框(ORF)，與林煙草CCD1基因長度相同，兩個物種序列同源性極高，僅存在一個堿基的差異。CCD1-2型基因包含一個1647 bp的ORF，與絨毛狀煙草CCD1基因長度也相同，也是存在一個堿基的差異。對K326CCD1 ORF進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CCD1-1與CCD1-2 同源性達(dá)97%。CCD1-1序列GC含量為43.24%，CCD1-2為42.87%。BLAST比對表明，CCD1-1與CCD1-2核苷酸序列與Genbank公布的藍(lán)格斯多夫煙草與美花煙草雜交種中的煙草類胡蘿卜素裂解雙氧合酶（CCD1）的同源性分別達(dá)98%和99%，與番茄CCD1-2的同源性均為92%，與辣椒、桂花以及葡萄CCD的同源性分別達(dá)84%、83%、80%和79%、80%、79%。因此，我們推測該CCD1-1與CCD1-2為煙草CCD1基因。

運用DNAstar軟件推測該基因的氨基酸序列，Expasy Protparam軟件分析蛋白質(zhì)的分子量、等電點和氨基酸組成。結(jié)果表明，CCD1-1與CCD1-2分別編碼544和548個氨基酸，各種氨基酸的組成如表1所示。其中堿性氨基酸(Arg、Lys) 分別為62個和65個,強酸性氨基酸 (Asp,Glu) 68個和71個,疏水氨基酸 (Ala、Ile、Leu、Phe、Trp、Val) 均為 181個,不帶電荷的極性氨基酸 (Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr) 118和116個。CCD1-1 20種氨基酸中含量最高的為Gly和Leu (8.6%),其次是Val (8.1%)、Lys (7.7%)、Glu (6.6%) 和 Pro (6.2%)。CCD1-2 20種氨基酸中含量最高的為Gly和Leu (8.6%),其次是Lys (8.0%)、Val (7.5%)、Glu (6.9%)和 Pro (6.2%)。預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量為均為61 kDa,理論等電點 (pI)為6.51和 6.55。

表1 K326 CCD1-1和K326 CCD1-2 氨基酸組成、數(shù)目及所占比例

2.2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

使用PROSITE和SMART軟件對該基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析和預(yù)測。如圖2-1和2-2所示，該基因編碼的蛋白包含CCD家族保守的結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步證實所克隆序列為編碼CCD蛋白的基因。

圖2-1 K326 CCD1-1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域

圖2-2 K326 CCD1-2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域

2.2.3 蛋白質(zhì)疏水性分析、跨膜區(qū)預(yù)測、信號肽和螺旋卷曲分析

蛋白質(zhì)疏水性分析、跨膜區(qū)預(yù)測和螺旋卷曲分析分別采用ProtScale、TMpred和 Coils軟件進(jìn)行。圖3-1給出的是煙草CCD1-1蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果。其疏水性最大值為2.15，最大親水峰有1處。親水性最大值為-3。在138～158位氨基酸間找到分值很高的1個跨膜螺旋區(qū)，其最可能的方向為從膜外到膜內(nèi)，N端在胞外。圖3-2 給出的是煙草CCD1-2蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果。其疏水性最大值為2.15，最大親水峰有3處，親水性最大值為-3。在142～162位氨基酸間找到分值很高的1個跨膜螺旋區(qū)，其最可能的方向為從膜外到膜內(nèi),N 端在胞外。推測煙草CCD蛋白為跨膜蛋白。螺旋卷曲分析顯示,CCD1-1與CCD1-2蛋白質(zhì)中沒有明顯的卷曲螺旋。

圖3-1 K326 CCD1-1蛋白質(zhì)疏水性分析

圖3-2 K326 CCD1-2蛋白質(zhì)疏水性分析

2.2.4 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

使用在線工具 SOPMA對該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明，CCD1-1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中含有16.91%的α螺旋、23.90%的β折疊、5.33%的轉(zhuǎn)角和53.86%的無規(guī)則卷曲。CCD1-2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中含有18.07%的α螺旋、22.81%的β折疊、5.47%的轉(zhuǎn)角和 53.65%的無規(guī)則卷曲，β折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成了CCD1蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要成分。

圖4 K326 CCD1-1與CCD1-2蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型

2.2.5 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模擬

將推測的氨基酸序列提交瑞士生物信息研究所Swiss-model，該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果如圖4所示。由此可以看出CCD1-1蛋白與CCD1-2蛋白均是以β折疊和無規(guī)則卷曲為主。且CCD1-1與CCD1-2蛋白三維結(jié)構(gòu)很相似，僅在無規(guī)則卷曲部分存在差異。

2.3 CCD1基因表達(dá)分析

采用RT-PCR分析煙草K326中CCD1-1與CCD1-2基因在煙株根、莖、葉和花中的表達(dá)情況可知，CCD1-1和CCD1-2均為在花中的表達(dá)最強，在葉和莖中的表達(dá)其次，根中的表達(dá)最弱（圖4）。

圖5 CCD1-1與CCD1-2在不同組織中的表達(dá)情況

3 結(jié)論與討論

本研究中，我們克隆并測得K326CCD1基因的2個拷貝的全長cDNA序列。它們與其它植物CCD1的相似性達(dá)到80%以上，證明我們克隆到的2個基因為煙草CCD1基因。2個拷貝之間相似性達(dá)97%，長度存在12個堿基的差異。其編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出很高的相似性，暗示這兩個拷貝功能可能類似。本研究同時對普通栽培煙草的兩個祖先種林煙草和絨毛狀煙草進(jìn)行了克隆，發(fā)現(xiàn)林煙草中的CCD1基因與普通煙草中的CCD1-1，絨毛狀煙草中的CCD1基因與普通煙草中的CCD1-2表現(xiàn)出極高的相似性，相互之間僅存在一個堿基的非同義突變。進(jìn)一步支持了林煙草和絨毛狀煙草是普通煙草父母本的推斷。同時也說明類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因在普通栽培煙草中是相當(dāng)保守的。我們后來對香料煙和白肋煙的研究結(jié)果（未發(fā)表）也證實了這一點。另外，跨膜分析表明，K326CCD1-1和CCD1-2均含有一個跨膜螺旋區(qū)，它們具有明顯的親水和疏水區(qū),這些特點提示K326CCD1可能為膜定位蛋白。

本研究對類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因的克隆和分析為進(jìn)一步利用過表達(dá)和敲除表達(dá)等方法研究該基因的功能提供了一定的研究基礎(chǔ)。相對于其它很多植物，目前對煙草類胡蘿卜素代謝尤其是降解的調(diào)控機制以及代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控了解有限。通過對類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因的研究可有助于闡明香氣物質(zhì)前體物產(chǎn)生的分子機理，從而為從分子水平上進(jìn)行代謝調(diào)控提供一定的理論依據(jù)。

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Cloning and expression of geneCCD1 critical to cleavage of tobacco carotenoid

YANG Yongxia,NIU Zhiqiang,ZHANG Songtao,CUI Hong,LIU Guoshun
National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Centre; College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou,450002,China

Tobacco carotenoids and their apocarotenoid derivatives play essential physiological and developmental roles and provide plants tolerance to a variety of stresses.Using RACE method,two copies (namedCCD1-1 andCCD1-2) of the full-length cDNA sequence of tobacco carotenoid cleavage oxygenases1 were cloned from K326.Sequences analysis showed thatCCD1-1 andCCD1-2 contained of open reading frame (ORF ) 1635-bp and 1647-bp and coded 544 and 548 amino acid residues with the theoretical isoelectric point (pI) of 6.51 and 6.55,respectively.The calculated molecular masses were both 157 kDa.The GC contents of two copied gene were 43.24% and 42.78%.The similarity ofCCD1 with tomato,pepper and other plants reached to more than 80%.Protein hydropho bicity and transmembrane region’s prediction analysis indicated that there was one transmembrane helical region from 138 to 158 amino acids inCCD1-1 and from 142 to 162 inCCD1-2.The secondary structure prediction results showed that they were mainly made up by beta turns and random coil.The tertiary structure prediction results displayed thatCCD1-1 showed high similarity withCCD1-2 except in random coil.Expression analysis showed that the expression level was highest in flower,and lowest in root.These results provide some basis for the function analysis toCCD1.

tobacco; clone; carotenoid cleavage oxygenases; sequence analysis

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.016

TS413

A

1004-5708（2014）01-0084-06

楊永霞(1980—)，女，博士，講師，研究方向為煙草生物技術(shù)，Tel：0371-63558121，Email：yyx624@126.com

劉國順(1954—)，男，教授，研究方向為煙草栽培與生理生化，Email：liugsh1851@163.com

河南省教育廳自然科學(xué)研究項目（No.2011B180025）; 中國煙草總公司特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項濃香型項目（No.110201101001).

2013-03-08