余婧，張孝廉，趙丹，鄒頡，趙杰宏

1 貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽550081；

2貴州煙葉復(fù)烤有限責(zé)任公司銅仁復(fù)烤廠，貴州 銅仁 554300；

3 貴州大學(xué)貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室，貴州 貴陽 550025

生物技術(shù)

煙草轉(zhuǎn)基因研究常用遺傳元件篩查策略

余婧1,2，張孝廉1，趙丹3，鄒頡1，趙杰宏1

1 貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽550081；

2貴州煙葉復(fù)烤有限責(zé)任公司銅仁復(fù)烤廠，貴州 銅仁 554300；

3 貴州大學(xué)貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室，貴州 貴陽 550025

通過檢索國 內(nèi)外近10年煙草轉(zhuǎn)基因研究的相關(guān)文獻(xiàn)，建立了轉(zhuǎn)基因煙草常用轉(zhuǎn)化遺傳元件的數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計(jì)了每個(gè)遺傳元件及組合元件的使用頻率后，發(fā)現(xiàn)利用7種遺傳元件，包括：啟動(dòng)子P-35S、標(biāo)記基因NPT II、HPT、Bar和aadA、報(bào)告基因GUS及終止子T-NOS作為靶標(biāo)元件組合，能使目前煙草轉(zhuǎn)基因 事件的理論篩 查率達(dá)到100%，從而構(gòu)建出轉(zhuǎn)基因煙草的優(yōu)化篩查策略。

轉(zhuǎn)基因煙草；遺傳元件；轉(zhuǎn)基因篩查

煙草制品作為一種特殊的消費(fèi)品，其吸食安全性一直是爭論的焦點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因煙草比其他轉(zhuǎn)基因植物更難獲得消費(fèi)者的認(rèn)可。轉(zhuǎn)基因煙草不能進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，且煙草制品中不能含有轉(zhuǎn)基因成分，煙草轉(zhuǎn)基因研究只能作為一種技術(shù)儲(chǔ)備[1]。在我國，我們一方面在加大轉(zhuǎn)基因研發(fā)力度，另一方面，也在強(qiáng)化對轉(zhuǎn)基因的監(jiān)管，嚴(yán)控轉(zhuǎn)基因污染[2]。煙草中轉(zhuǎn)基因成分的檢測是一個(gè)復(fù)雜的問題，涉及技術(shù)、法律及商業(yè)信息，國際上尚無統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)。

轉(zhuǎn)基因成分檢測主要包括基于DNA檢測和基于蛋白質(zhì)檢測的方法，其中基于DNA的轉(zhuǎn)基因檢測方法應(yīng)用最為廣泛[3]，例如實(shí)時(shí)熒 光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒綉?yīng)（RQ-PCR） 被廣泛應(yīng)用于定量檢測食品或飼料中的轉(zhuǎn)基因成份含量[4]?；贒NA的轉(zhuǎn)基因檢測方法首先通過對某些遺傳元件進(jìn)行篩查，例如導(dǎo)入的外源表達(dá)基因、用于篩選陽性植株的篩選標(biāo)記基因、以及各種啟動(dòng)子、終止子，挑選出使用頻率最高的少數(shù)幾個(gè)遺傳元件作為檢測靶標(biāo)，如果檢測出其中任何一個(gè)元件，表明該樣品含有轉(zhuǎn)基因成分，如果未檢出，則表明樣品中不含有已知轉(zhuǎn)基因成分，不同作物使用的遺傳元件種類和頻次各不相同，因此不同作物需根據(jù)具體情況采用合適的篩查檢測策略[5-6]。

目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物遺傳元件篩查信息的報(bào)道，研究對象多為玉米、大豆、油菜、棉花、水稻等國際上商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物[6-8]，而有關(guān)轉(zhuǎn)基因煙草遺傳元件篩查的文獻(xiàn)未見報(bào)道，本文根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的有關(guān)煙草遺傳轉(zhuǎn)化的研究文獻(xiàn)，統(tǒng)計(jì)部分常用遺傳轉(zhuǎn)化元件在煙草遺傳轉(zhuǎn)化中出現(xiàn)的頻率，以期篩選出煙草轉(zhuǎn)基因檢測中理論覆蓋率最高的基因元件組合，為煙草轉(zhuǎn)基因檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

在中國知網(wǎng)全文期刊數(shù)據(jù)庫（http://www.cnki.net/）輸入關(guān)鍵詞“轉(zhuǎn)基因煙草”，在google學(xué)術(shù)搜索（http://scholar.google.com/）輸入關(guān)鍵詞“transgenic tobacco”，搜索近10年來國內(nèi)及國外有關(guān)轉(zhuǎn)基因煙草的研究情況，對文獻(xiàn)所報(bào)道的轉(zhuǎn)入煙草的外源基因啟動(dòng)子、終止子和篩選標(biāo)記基因進(jìn)行篩查，并統(tǒng)計(jì)各單個(gè)遺傳元件及遺傳元件組合在煙草遺傳轉(zhuǎn)化研究中的使用頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草轉(zhuǎn)基因研究中高頻使用遺傳元件

在我們的篩查中，隨機(jī)選取近10年來有關(guān)煙草轉(zhuǎn)基因研究報(bào)道共229篇，根據(jù)所收集的信息，目前煙草轉(zhuǎn)基因研究中常用的啟動(dòng)子主要有P-35S，篩選標(biāo)記基因主要有：NPT II、HPT、Bar，報(bào)告基因主要有：GUS、GFP，終止子主要有T-NOS、T-35S、T-OCS。部分轉(zhuǎn)化事例中還使用到單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化常用啟動(dòng)子P-Ubi[9-11]，誘導(dǎo)表達(dá)或特異性表達(dá)啟動(dòng)子Napin[12]、RD29A[13]、PrbcS[14]等啟動(dòng)子約40種，aadA[15]、OFP[16]等篩選、報(bào)告基因及Cry1A[17]、OsLS[18]、PtrMAPK[19]等抗蟲、抗病、抗旱相關(guān)功能基因約200種，共涉及250種以上遺傳元件。部分較為常用的遺傳元件來源及功能見表1。

表1 煙草遺傳轉(zhuǎn)化部分常用遺傳元件來源及功能Tab.1 Source and function of common genetic elements in genetic transformation part of tobacco

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草研究中單個(gè)遺傳元件使用頻率

所篩查的有關(guān)轉(zhuǎn)基因煙草研究的229篇文獻(xiàn)中，國內(nèi)期刊文獻(xiàn)166篇，國外期刊文獻(xiàn) 63篇。由于涉及文獻(xiàn)數(shù)量及轉(zhuǎn)化事件較多，我們無法按目前國際上所流行的單個(gè)事件單個(gè)列出的方式進(jìn)行矩陣統(tǒng)計(jì)[6-8]，于是將搜索到的有關(guān)文獻(xiàn)按其轉(zhuǎn)化事件的目的進(jìn)行分類，分為“品質(zhì)改良”、“生物反應(yīng)器”、“生態(tài)環(huán)境效益改良”、“基因功能驗(yàn)證分析”、“其它”五種類型，其中，“基因功能驗(yàn)證分析”分為“啟動(dòng)子功能”、“表達(dá)基因功能”兩種類型。

以轉(zhuǎn)化事件的分類為列，常用遺傳元件為行，統(tǒng)計(jì)各遺傳元件在轉(zhuǎn)基因煙草研究中的使用頻率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2。表達(dá)基因啟動(dòng)子P-35S使用頻率最高，在國內(nèi)及國外所報(bào)道的文獻(xiàn)中，其使用頻率分別為65.1%、74.6%，綜合使用頻率67.7%；表達(dá)基因終止子T-NOS使用頻率最高，綜合使用頻率67.7%；篩選標(biāo)記基因NPT II使用頻率最高，綜合使用頻率63.3%；報(bào)告基因GUS使用頻率最高，綜合使用頻率25.8%。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草研究中常用遺傳元件組合篩查

從表2可以看出，沒有任何單個(gè)遺傳元件的使用頻率達(dá)到100%，因此無法用單個(gè)元件檢測出所有的轉(zhuǎn)基因煙草，為盡最大可能檢測到煙草轉(zhuǎn)基因事件，需使用兩個(gè)元件以 上的組合進(jìn)行篩查。

我們將使用頻率偏高的元件組合后進(jìn)行篩查，篩查結(jié)果列于表3。其中①號組合：P-35S+T-NOS是國際上較為常用的轉(zhuǎn)基因作物篩查組合元件[3,20]，目前批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物90%以上至少含有這二種元件的一個(gè)[21]，在我們的篩 查中，煙草轉(zhuǎn)基因研究中有86.0%的轉(zhuǎn)化事件使用到①號組合中的一個(gè)元件，即該組合的理論篩查覆蓋率為86.0%；表3中，③號組合：P-35S+T-NOS+NPT II理論篩查覆蓋率為90.0%，而CORESTA（Task Force Genetically Modified Tobacco-Detection Methods）[22]、GB/T 24310-2009 《煙草及煙草制品 轉(zhuǎn)基因檢測方法》[23]將P-35S、T-NOS、NPT II三種遺傳元件作為轉(zhuǎn)基因煙草檢測中共有序列標(biāo)志，可是在該檢測中，即使用三個(gè)元件同時(shí)進(jìn)行檢測，理論上仍然約有10%的煙草轉(zhuǎn)基因污染事件會(huì)被漏檢。

為最大限度的檢測到煙草轉(zhuǎn)基因事件，我們在③號組合的基礎(chǔ)上加了GUS、HPT等常用遺傳元件組合，盡管⑦號組合：P-35S + T-NOS +NPT II+GUS+Hpt+Bar所選遺傳元件均為煙草轉(zhuǎn)基因事件中常使用的基因元件，但經(jīng)我們篩查，其覆蓋率為98.7%，理論上仍有1.3%的煙草轉(zhuǎn)基因事件會(huì)被漏檢，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)該漏檢元件均為aadA基因，aadA基因所編碼的壯觀霉素抗性基因是煙草葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)中最常用、最好的篩選標(biāo)記[24]，在部分煙草葉綠體轉(zhuǎn)基因事件中，該篩選標(biāo)記基因及表達(dá)基因的啟動(dòng)子及終止子均為特異的[15,25-27]，因此，即使使用⑦號組合中的所有元件進(jìn)行檢測，也不能覆蓋到該類型的轉(zhuǎn)基因事件，在表2中，盡管所統(tǒng)計(jì)的aadA基因的使用頻率僅為4.4%，但鑒于該轉(zhuǎn)化事件的特殊性，為不使煙草葉綠體轉(zhuǎn)化事件漏檢，最高限度降低轉(zhuǎn)基因事件的漏檢 率，綜合以上 分析，我們建議以⑨號組合：P-35S + T-NOS +NPT II+GUS+HPT+Bar+aadA進(jìn)行篩查，能最大限度檢測到轉(zhuǎn)基因事件，該組合涉及7個(gè)遺傳元件，理論篩查覆蓋率為100%。

表2 煙草轉(zhuǎn)基因研究中常用遺傳元件使用頻率Tab.2 Usage frequency of common genetic elements in transgenic tobacco research

表2（續(xù)）

表3 煙草轉(zhuǎn)基因研究中常用遺傳元件組合篩查Tab.3 Screening of common combined genetic elements in the study of transgenic tobacco

3 討論

1983年，首例含有抗生素藥類的轉(zhuǎn)基因煙草在美國培育成功[28]，之后的30年間，轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展十分常迅猛，轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品大量問世[29-30]。煙草作為基因工程研究中使用最為廣泛，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)最為成熟的模式植物[31-32]，各科研單位遺傳轉(zhuǎn)化煙草的目的不僅僅是對其品質(zhì)進(jìn)行遺傳改良[33]，更多的是將外源基因?qū)霟煵?，在轉(zhuǎn)基因煙草中對未知基因進(jìn)行分析、驗(yàn)證、發(fā)掘，或?qū)煵葑鳛樯锓磻?yīng)器生產(chǎn)研制基因工程藥物、天然香料及化工原料等[30,32-34]。

隨著煙草轉(zhuǎn)基因研發(fā)力度的不斷加大，國家局為保證我國煙草制品吸食安全性，自2003年，便已下發(fā)《國家煙草專賣局關(guān)于加強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因煙草監(jiān)控的通知》國煙科〔2003〕387號，對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行監(jiān)控、檢測，嚴(yán)防煙草制品轉(zhuǎn)基因污染。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的轉(zhuǎn)基因案例中采用了全新的啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因，使得現(xiàn)在常用的篩選元件覆蓋面減小，失去篩選的意義[20]，因此，對煙草轉(zhuǎn)基因檢測而言，有必要對現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因事件中所使用的遺傳元件進(jìn)行分析，并根據(jù)這些信息再次篩選合適的篩查靶標(biāo)。本文通過對229篇轉(zhuǎn)基因煙草研究中所用遺傳元件進(jìn)行篩查，最終選定P-35S+T-NOS+NPT II+GUS+HPT+Bar+aadA這一組合為理想篩查組合，主要考慮以下因素：1）盡管部分煙草轉(zhuǎn)基因事件采用新的遺傳元件，但P-35S、T-NOS、NPT II三種元件在遺傳轉(zhuǎn)化研究中原理、技術(shù)最為成熟，因此，煙草轉(zhuǎn)化事件中使用三種元件其中之一分別作為啟動(dòng)子、終止子或篩選標(biāo)記基因的頻率仍然較高，且它們?yōu)閲H上較為流行的轉(zhuǎn)基因作物檢測靶標(biāo)序列；2）在以上三種元件組合使用的基礎(chǔ)上，加入GUS、HPT、Bar三種遺傳元件能增加篩查覆蓋頻率；3）加入aadA基因能檢測到部分煙草葉綠體轉(zhuǎn)化事件，降低漏檢風(fēng)險(xiǎn)。

本文首次統(tǒng)計(jì)并分析了近10年來國內(nèi)外文獻(xiàn)所報(bào)道的煙草轉(zhuǎn)基因事件，建立了煙草轉(zhuǎn)基因研究常用遺傳元件數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建P-35S+T-NOS+NPT II+GUS+HPT+Bar+aadA 7種遺傳元件的最優(yōu)篩查組合策略，理論篩查覆蓋率為100%，并首次提 出將aadA基因納入篩查組合，防止部分煙草葉綠體轉(zhuǎn)化事件的漏檢。值得提出的是，我們的篩查組合是通過對煙草轉(zhuǎn)基因“已發(fā)生事件”的統(tǒng)計(jì)而篩選出，就目前而言是可行的，但隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷進(jìn)步及發(fā)展， 該策略并不意味著對“將來發(fā)生事件”的檢測能達(dá)到100%。

綜上，該篩查策略的提出，進(jìn)一步完善了現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測體系，為行業(yè)當(dāng)前煙草轉(zhuǎn)基因的檢測提供了篩查依據(jù)。

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Screening strategy of genetic elements used in transgenic study

YU Jing1,2,ZHANG Xiaolian1,ZHAO Dan3,ZOU Jie1,ZHAO Jiehong1
1 Key Laboratory of Molecular Genetics,Guizhou Tobacco Research Institute,Guiyang 550081,Guizhou,China;
2 Guizhou Tongren Tobacco Leaf Redrying Co.,Ltd.,Tongren 554300,Guizhou,China;
3 Guizhou Key Laboratory of Agricultural Bioengineering,Guizhou University,Guiyang 550025,Guizhou,China

A transgenic tobacco database of routine genetic elements was established based on literature review of t ransgenic tobacco research in the last 10 years.Genetic elements that were commonly used in transgenic tobacco research were screened to reveal frequency of individual and combination of genetic elements.A combination of P-35S promoter,NPT II/HPT/Bar/aadA selective marker genes,GUS reporter gene and T-NOS te r minator as screening target elements can make screening rate of transgenic tobacco reach 100% in theory.Thus,an optimized screening s trategy for transgenic tobacco is being laid out.

transgenic tobacco; genetic elements; transgenic screening

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.015

TS413

A

1004-5708（2014）01-0078-06

貴州省科學(xué)技術(shù)基金“富鉀基因發(fā)掘及無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因煙草培育研究”（黔科合J字[2010]2251）；中國煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目“抗TMV富K轉(zhuǎn)基因煙草育種研究”（200910）； 貴州省科技支撐計(jì)劃農(nóng)業(yè)攻關(guān)“轉(zhuǎn)基因烤煙檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和檢測技術(shù)研究及應(yīng)用”（黔科合NY[2013]3020號）

余婧（1983—），女，碩士，農(nóng)藝師，主要從事煙草轉(zhuǎn)基因檢測及煙草生物技術(shù)研究，Email:yujingbio@126.com

趙杰宏（1978—），男，博士，副研究員，主要從事煙草生物技術(shù)研究，Email:zhaojiehong@126.com

2013-05-30