陳澤斌，代方平，寸林江，李，陳艷芳，許石劍，方飛，黃楊

1昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南省高校都市型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程研究中心，昆明 650214；

2 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 653100；

3黔西州煙草公司興仁縣分公司，貴州 興仁 562300；

4德宏州環(huán)境保護(hù)局，云南 芒市678400；

5無錫園林建設(shè)工程管理處，江蘇 無錫 214072

煙草內(nèi)生細(xì)菌分離方法的優(yōu)化研究

陳澤斌1,2，代方平1，寸林江1，李1，陳艷芳1，許石劍3，方飛4，黃楊5

1昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南省高校都市型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程研究中心，昆明 650214；

2 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 653100；

3黔西州煙草公司興仁縣分公司，貴州 興仁 562300；

4德宏州環(huán)境保護(hù)局，云南 芒市678400；

5無錫園林建設(shè)工程管理處，江蘇 無錫 214072

用研磨組織稀釋分離法與表面消毒有效性評(píng)價(jià)相結(jié)合的方法確定了適宜煙草組織的表面消毒方法以及內(nèi)生細(xì)菌分離培養(yǎng)基。采用1%次氯酸鈉浸泡5 min，再用75%酒精浸泡2分鐘能夠100%去除表面附生菌，并且分離得到更多的內(nèi)生細(xì)菌。研究比較了TSA、NA、PDA、LB 四種常用的細(xì)菌分離培養(yǎng)基在分離煙草內(nèi)生細(xì)菌中的差異，其中TSA和NA培養(yǎng)基分離得到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量較高，TSA培養(yǎng)基從煙草根、莖、葉中分離出的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量分別為5.18 log cfu/g.fw、2.17 log cfu/g.fw、4.69 log cfu/g.fw；NA培養(yǎng)基分別為5.01 log cfu/g.fw、1.81 log cfu/g.fw、4.93 log cfu/g.fw。對(duì)分離得到的127株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定表明，TSA和NA培養(yǎng)基分離得到的內(nèi)生細(xì)菌種類最多，其中TSA培養(yǎng)基分別從根、莖、葉中分離到9、7、13種內(nèi)生細(xì)菌；其次是NA培養(yǎng)基，分別從根、莖、葉中分離到8、6、10種內(nèi)生細(xì)菌。結(jié)果表明，采用TSA和NA培養(yǎng)基分離煙草內(nèi)生細(xì)菌，可以達(dá)到較為理想的分離效果。

煙草；內(nèi)生細(xì)菌；分離；優(yōu)化

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部的微生物，屬于植物組織內(nèi)的正常菌群[1]。世界上大約有30萬種植物，目前人們僅僅研究了幾百種植物的內(nèi)生細(xì)菌，在已經(jīng)研究的植物當(dāng)中，幾乎每種植物都具有豐富的內(nèi)生細(xì)菌存在。人們從中不僅分離鑒定出多種細(xì)菌新種，還獲得了一大批具有防病，促生或內(nèi)生固氮等生物學(xué)功能的內(nèi)生細(xì)菌，顯示出了良好的研究和應(yīng)用前景[2-5]，內(nèi)生細(xì)菌已成為植物學(xué)、微生物學(xué)、植物保護(hù)學(xué)及植物育種學(xué)等多學(xué)科的研究熱點(diǎn)。

在植物內(nèi)生細(xì)菌的研究中，不同學(xué)者針對(duì)不同的植物樣品采用不同的分離培養(yǎng)方法。由于培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)成分、離子濃度以及酸堿度等條件不同，導(dǎo)致不同培養(yǎng)基對(duì)于微生物具有不同選擇性[6-7]，而且不同的稀釋梯度、消毒劑的選擇及其消毒時(shí)間對(duì)微生物分離數(shù)量也有影響。本文通過不同消毒劑、消毒時(shí)間、培養(yǎng)基的優(yōu)化組合，探討適宜其內(nèi)生細(xì)菌分離條件，建立和完善煙草內(nèi)生細(xì)菌分離體系和培養(yǎng)方法。為后續(xù)的內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2012年8月下旬，取云南玉溪世界煙草品種園煙草品種K326成熟期的根、莖、葉為試驗(yàn)材料，選擇生長良好、無病害健康植株。取樣后立即放入樣品袋中，低溫保鮮，在24 h之內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

培養(yǎng)基配方見表1，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、16S rDNA片段擴(kuò)增所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為寶生物工程（大連）產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 培養(yǎng)基配方Tab.1 Culture medium components

1.3 分離培養(yǎng)條件的選擇

1.3.1 消毒劑及消毒時(shí)間的選擇

用0.1% SDS浸泡根、莖和葉片樣品10 min，再用自來水沖洗表面，濾紙吸去水分，隨機(jī)取3種樣品各0.4 g，無菌條件下分別采用6種方法消毒處理（見表2）。分別取最后一次無菌水沖洗液200 μL涂布NA固體培養(yǎng)基，每處理3次重復(fù)，28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，并設(shè)無菌水沖洗組織做對(duì)照，記錄各處理菌落數(shù)量，計(jì)算表面除菌率。表面除菌率=（未經(jīng)消毒劑處理的材料表面細(xì)菌數(shù)－消毒劑處理后的材料表面細(xì)菌數(shù)）/ 未經(jīng)消毒劑處理的材料表面細(xì)菌數(shù)×100%[11]。

表2 三種消毒劑及其不同的消毒處理方式Tab.2 Different treatments of three chemical reagents

1.3.2 培養(yǎng)基種類的選擇

按1.3.1中處理5的方法將煙草的根、莖、葉各0.4 g消毒處理后用無菌水沖洗4次，無菌濾紙吸去表面水分后，分別與一大一小滅菌鋼珠一并放入2mL滅菌離心管，加入600 μL無菌水，用QIAGEN高通量組織研磨器研磨3 min，頻率為30 r/s。研磨后的汁液用無菌水梯度稀釋至10-4，取10-2，10-3，10-4三個(gè)稀釋度的菌懸液各200 μL分別涂布于TSA、NA、PDA、LB平板上；同時(shí)取最后一次植物組織沖洗液200 μL分別涂布TSA、NA、PDA、LB平板上為對(duì)照，每濃度涂3個(gè)平板。將平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察不同培養(yǎng)基及不同稀釋度下菌落生長情況，根據(jù)菌落的形態(tài)和數(shù)量確定適宜的培養(yǎng)基種類。

1.4 菌落計(jì)數(shù)

選取合適的濃度（每皿30-300個(gè)菌落）計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算每克植株鮮重所含的活菌數(shù)cfu/g.fw =（菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×分離用水量）／（涂板用水量×分離組織重量）。并轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)值log cfu/g.fw（Colony-Forming Units Per Gram Fresh Weight）。

1.5 內(nèi)生細(xì)菌的分離和保存

按1.3.1中處理5的方法進(jìn)行表面消毒，以TSA、NA、PDA、LB作為分離培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)煙草根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌，每處理重復(fù)3次。28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d后取出，用記號(hào)筆從背面標(biāo)出形態(tài)相異的菌落，編號(hào)并統(tǒng)計(jì)。挑取單菌落于NA斜面28 ℃培養(yǎng)3 d后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

按文獻(xiàn)[12]的方法。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用WPS Of fice 2012個(gè)人版軟件和DPS7.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑及消毒時(shí)間的選擇

不同消毒處理對(duì)煙草不同組織的表面除菌效果不同（表3）。三種消毒劑除菌能力的大小依次為：0.1%升汞 ＞ 1%次氯酸鈉 ＞ 75%酒精。處理3中，0.1%的升汞不需要與1%次氯酸鈉配合使用除菌率就能達(dá)到100%；在處理6中，只用75%酒精單獨(dú)處理，未用0.1%升汞與1% NaClO浸泡，表面除菌效果相比其它五種處理較差，對(duì)煙草各組織表面的除菌率為55% -100%，這可能與煙草各器官的組織致密性及所處生長環(huán)境有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明處理1、2、3、4、5均能徹底滅活植物組織表面的微生物。從不同消毒處理后內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量來看（表4），處理5從根、莖、葉分離到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量均比處理1、2、3、4要多?？赡苁且?yàn)樘幚?、2、3、4用0.1%升汞或1%NaClO消毒浸泡的時(shí)間均比處理5時(shí)間長，消毒劑滲入植物組織殺死了部分內(nèi)生細(xì)菌，鑒于此，在保證表面消毒效果的前提下，為了分離得到更多的內(nèi)生菌，選擇處理5的消毒劑組合和消毒時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表3 各組織不同表面消毒時(shí)間的除菌率Tab.3 Sterilization rate of different tissue samples by different disinfectants

表4 不同消毒處理后內(nèi)生細(xì)菌分離數(shù)量Tab.4 Numbers of endophytic bacteria after different sterilization treatments

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)煙草內(nèi)生細(xì)菌分離數(shù)量的影響

采用處理5方法表面消毒后，研磨各無菌材料，梯度稀釋后涂布于4種培養(yǎng)基上（圖1），培養(yǎng)3 d后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，不同培養(yǎng)基的內(nèi)生細(xì)菌分離數(shù)見表5。分離數(shù)由多到少依次為：TSA ＞ NA ＞ LB ＞PDA。其中TSA和NA培養(yǎng)基分離得到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最高，與其它培養(yǎng)基分離得到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量相比差異顯著（α=0.05）。TSA培養(yǎng)基從煙草根、莖、葉中分離出的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量分別為5.18 log cfu/g.fw、2.17 log cfu/g.fw、4.69 log cfu/g.fw；NA培養(yǎng)基從煙草根、莖、葉中分離出的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量分別為5.01 log cfu/g.fw、1.81 log cfu/g.fw、4.93 log cfu/g.fw。結(jié)果表明，利用TSA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基能夠分離出更多的煙草內(nèi)生細(xì)菌。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，上述4種培養(yǎng)基對(duì)煙草根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌分離的菌落數(shù)量由多到少依次為：根 ＞ 葉 ＞ 莖，暗示煙草根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量存在差異。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)煙草葉片內(nèi)生細(xì)菌分離的效果（10-3）Fig.1 Separationeffect of endophytic bacteria isolated from tobacco leaves using different medium (10-3)

表5 不同培養(yǎng)基對(duì)煙草內(nèi)生細(xì)菌分離數(shù)量的影響Table 5 Numbers of endophytic bacteria isolated from tobacco using different medium

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)煙草內(nèi)生細(xì)菌分離種類的影響

PCR擴(kuò)增得到不同培養(yǎng)基上分離得到的127株內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA片段，委托上海英駿生物技術(shù)公司對(duì)16S rDNA片段進(jìn)行序列測(cè)定，通過BLAST尋找與目的序列同源性最高的已知分類地位菌種的16S rDNA序列進(jìn)行比較鑒定，結(jié)果見表6，不同培養(yǎng)基分離得到內(nèi)生細(xì)菌種類數(shù)由多到少依次為TSA ＞NA ＞ LB ＞ PDA，其中TSA培養(yǎng)基分離得到的細(xì)菌種類最多，分別從根、莖、葉分離到9、7、13種細(xì)菌；其次是NA培養(yǎng)基，分別從根、莖、葉分離到8、6、10種細(xì)菌。LB和PDA培養(yǎng)基上雖然也可以分離出大量的內(nèi)生細(xì)菌，但分離出來的菌落較單一（圖1），而TSA和NA平板則可以分離出較多的具有不同菌落形態(tài)和顏色的內(nèi)生細(xì)菌；利用LB和PDA培養(yǎng)基分離到的菌株，通過TSA和NA培養(yǎng)基大部分都能夠分離到（表6），表明TSA和NA培養(yǎng)基為分離煙草內(nèi)生細(xì)菌的最適宜培養(yǎng)基。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，4種培養(yǎng)基對(duì)煙草根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌分離的種類數(shù)量由多到少依次為：葉 ＞ 根 ＞ 莖，說明煙草不同器官中內(nèi)生細(xì)菌的種類存在差異。

3 討論

內(nèi)生細(xì)菌的分離程序中，表面消毒是關(guān)鍵步驟，選擇合適的消毒劑和消毒時(shí)間在內(nèi)生細(xì)菌的前期研究中是非常重要的，既要保證能除掉表面的附生菌，又要能最大限度的不對(duì)組織造成破壞從而影響內(nèi)生細(xì)菌的長出[13]。鑒于此，本研究綜合考慮表面滅菌效果以及各消毒處理后分離出的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量，選擇處理5的消毒劑組合和消毒時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

在培養(yǎng)基選擇方面，本研究利用目前普遍采用的4種細(xì)菌培養(yǎng)基分離煙草內(nèi)生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)TSA和NA培養(yǎng)基分離出的煙草內(nèi)生細(xì)菌無論從數(shù)量上還是種類上都顯著優(yōu)于其它培養(yǎng)基的分離效果；可以認(rèn)為TSA和NA培養(yǎng)基是分離煙草內(nèi)生細(xì)菌的最適宜培養(yǎng)基。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同煙草器官中的內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和種類存在一定的差異，暗示內(nèi)生細(xì)菌在煙草植株中分布不均勻，且寄生程度不同，不同器官和內(nèi)生細(xì)菌之間可能有相互選擇的關(guān)系。己有的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌的種群密度取決于植物品種、植物的基因型、植物組織、植物生長期和環(huán)境條件[14-15]，本研究也體現(xiàn)了這一特點(diǎn)。

本研究表明煙草根、莖、葉內(nèi)均存在大量的內(nèi)生細(xì)菌，其中以根中最多，其次為葉，莖中最少。文獻(xiàn)報(bào)道的黃瓜、豆類等大多數(shù)植物內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量分布規(guī)律總體為[16-17]：地下組織高于地上組織，根中最多，其次是莖和葉片，這與本研究得出的結(jié)果一致。

此外，不同培養(yǎng)基分離得到的內(nèi)生細(xì)菌的種群數(shù)量存在一定差異。在分離得到的全部種類的菌株中，發(fā)現(xiàn)個(gè)別種類的菌株只在一種或者幾種培養(yǎng)基上被分離得到，例如從根部分離得到的海水芽孢桿菌，只在TSA培養(yǎng)基上被分離到；木膠節(jié)桿菌只在LB培養(yǎng)基上被分離到；嗜硼芽孢桿菌只在NA培養(yǎng)基上被分離到；腸桿菌只在PDA培養(yǎng)基上被分離到。T abacchioni等[18]在關(guān)于玉米根際微生物遺傳多樣性的報(bào)道中也指出，利用不同分離培養(yǎng)基得到的根際微生物的種群數(shù)量存在一定差異。孫曉棠等[19]的研究也證實(shí)不同培養(yǎng)基分離得到番茄根際細(xì)菌的種群數(shù)量存在一定差異。胡元森等[20]在利用DGGE方法研究不同培養(yǎng)基分離土壤細(xì)菌的研究中也曾報(bào)道，在分離土壤細(xì)菌的7種培養(yǎng)基上均可培養(yǎng)的細(xì)菌只占6.25%，其他可培養(yǎng)細(xì)菌只在幾種甚至一種培養(yǎng)基中分離得到。這與本研究得出的結(jié)果一致。這可能是因?yàn)椴煌囵B(yǎng)基對(duì)不同種類菌株的選擇壓力不同所造成的，有待進(jìn)一步研究。

利用TSA和NA培養(yǎng)基能分離到較多數(shù)量和種類的內(nèi)生細(xì)菌，然而其它培養(yǎng)基又能分離到TSA和NA培養(yǎng)基分離不到的種類的細(xì)菌。說明在分離植物內(nèi)生細(xì)菌的過程中，應(yīng)盡可能采用多種具有不同選擇性的分離培養(yǎng)基，這樣才能得到較為豐富的植物內(nèi)生細(xì)菌資源。

表6 不同培養(yǎng)基對(duì)煙草內(nèi)生細(xì)菌分離種類的影響Tab.6 Species of endophytic bacteria isolated from tobacco using different medium

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Research on separation optimization of endophytic bacteria in tobacco

CHEN Zebin1,2,DAI Fangping1,CUN Linjiang1,LI Qi1,CHEN Yanfang1,XU Shijian3,FANG Fei4,HUANG Yang5

1 Engineering Research Center for Urban Modern Agriculture of Higher Education in Yunnan Province,Agriculture School,Kunming University,Kunming 650214,China;
2 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences,Yuxi 653100,Yunnan,China;
3 Xingren Branch of Qianxinan Municipal Tobacco Campany,Xingren 562300,Guizhou,China;
4 Environmental Protection Bureau of Dehong District,Mangshi 678400,Yunnan,China;
5 Wuxi Park Construction and Engineering Management Department,Wuxi 214072,Jiangsu,China

The best surface sterilization method and isolation medium of endophytic bacteria in tobacco were determined by grinding separation and surface sterilization ef ficacy check.Results showed that isolation and disinfection effect of soaking by 1% NaClO (5 min) +75% alcohol (2 min) was better in that surface epiphytic bacteria can be 100% eliminated and more bacteria can be separated.Four isolating media including Nutrient Agar (NA),Tryptic Soy Agar (TSA),Potato Dextrose Agar (PDA),Luria - Bertani medium (LB) were utlized to isolate endophytic bacteria from tobacco,aiming at comparing difference of isolation effect between them.Results showed that the isolation effect of TSA and NA was better than that of other media,while LB and PDA showed the lowest isolation effect.The amount of bacteria isolated from root,stem,leaf by TSA medium were 5.18 log cfu/g.fw,2.17 log cfu/g.fw,4.69 log cfu/g.fw respectively.The amount of bacteria isolated from root,stem,leaf by NA medium are 5.01 log cfu/g.fw,1.81 log cfu/g.fw,4.93 log cfu/g.fw respectively.The 16S rDNA of 127 endophytic strains were sequenced.Nine,seven and 13 different kinds of bacteria were isolated from root,stem,leaf by TSA medium respectively while only 8,6 and 10 different kinds of bacteria isolated from root,stem,leaf by NA medium.These results indicated that TSA and NA medium were suitable for isolating endophytic bacteria in tobacco by which ideal separating effect can be obtained.

tobacco；endophytic bacteria；separation；optimization

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.017

TS414

A

1004-5708（2014）01-0090-06

由云南省煙草公司科技項(xiàng)目(2012YN06)、昆明學(xué)院大學(xué)生科學(xué)研究項(xiàng)目(XJDNX010)、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30860017)

陳澤斌（1985—），博士，講師。主要研究方向：煙草內(nèi)生細(xì)菌多樣性，Email：zbchenkmu@163.com

2013-06-04