林小峰,吳玉萍,陳學(xué)軍,孔光輝

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，分析測試中心，云南省玉溪市高新開發(fā)區(qū)南祥路14號 653100；

2 云南大學(xué)，材料科學(xué)與工程系，云南省昆明市五華區(qū)翠湖北路2號 650091

苯酚提取-超高效液相色譜法測定煙草中的磷酸腺苷

林小峰1,2,吳玉萍1,陳學(xué)軍1,孔光輝1

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，分析測試中心，云南省玉溪市高新開發(fā)區(qū)南祥路14號 653100；

2 云南大學(xué)，材料科學(xué)與工程系，云南省昆明市五華區(qū)翠湖北路2號 650091

建立了苯酚提取超高效液相色譜法（UPLC）同時測定新鮮煙葉中三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和單磷酸腺苷（AMP）的分析方法。苯酚提取樣品溶液中的ATP、ADP和AMP較穩(wěn)定，不易水解，樣品在2 h以內(nèi)各磷酸腺苷變化率小于10%。采用6‰三乙胺（pH=6.6）和甲醇作為流動相梯度洗脫，3種磷酸腺苷在10 min內(nèi)實現(xiàn)了較好的分離，線性范圍（5～200）μg/mL內(nèi)，磷酸腺苷濃度與峰面積相關(guān)性很高（r＞0.9999），3種磷酸腺苷 檢測限均小于0.5 μg/mL，回收率在91.68%～110.79%之間，RSD在1.53%～3.67%之間。

超高效液相色譜；磷酸腺苷；苯酚；新鮮煙草

磷酸腺苷在生物體生存和繁殖中占據(jù)重要地位，測定磷酸腺苷(ATP,adenosine 5’-triphosphate;ADP,adenosine 5’-diphosphate; AMP,adenosine 5’-monophosphate)含量廣泛應(yīng)用于監(jiān)測和評估各種細(xì)胞和組織間的代謝活動。盡管最近研究表明ATP能作為某些疾病的一種有效生物標(biāo)志物[1-3]，但對于其他磷酸腺苷（ADP、AMP）在不同器官或系統(tǒng)中生理或病理的確切作用，其重要性在很大程度上仍然未開發(fā)。而ATP對植物，特別是煙草的遺傳育種、生長發(fā)育、品質(zhì)控制等方面起著重要作用。國內(nèi)外報道的ATP檢測文獻(xiàn)較多，其中動物組織[4-6]或者其代謝產(chǎn)物[7-9]占據(jù)很大部分，國外關(guān)于ATP的高效、專一檢測研究試驗[10-16]也較多。ATP含量檢測歷來使用較多的是熒光素-熒光素酶發(fā)光檢測技術(shù)[17]。近年來，高效液相色譜-紫外檢測器(HPLC-UV)，或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)已用于各種生物樣品[18]的檢測。早前報道的ATP提取方法包括強(qiáng)酸提取，有機(jī)溶劑提取，熱提取，超聲波提取等[19-21]；最新的報道[22-23]顯示，采用陽離子表面活性劑作為細(xì)菌細(xì)胞的ATP提取劑也具有相當(dāng)可行性。

然而目前的提取方法對復(fù)雜樣品中ATP的提取效果不佳：利用沸水，氯仿，正丁醇提取樣品中的ATP，提取效率均不太理想[24]，超聲波提取僅僅局限于微生物，該方法得不到廣泛推廣，陽離子表面活性劑等應(yīng)用較少。利用高氯酸或者正丁醇對ATP進(jìn)行提取因其污染少，步驟簡單而受到青睞，在現(xiàn)階段是主要的提取方法，但仍存在一些問題需要進(jìn)一步探討，一是需要進(jìn)行去除高氯酸處理，二是提取的樣品穩(wěn)定性較差，不易存放等。本項研究比較高氯酸和苯酚法之間提取效果和樣品穩(wěn)定性，結(jié)果表明苯酚在提取效果和樣品穩(wěn)定性上均優(yōu)于高氯酸。

檢測方法方面，生物發(fā)光分析技術(shù)檢測ATP比較方便快捷，但不能同時檢測ATP、ADP和AMP，且試劑盒價格高昂。高效液相色譜法是檢測ATP的首選，高效液相色譜法流動相一般采用磷酸鹽緩沖溶液和有機(jī)溶劑梯度洗脫[25-30]，而另外一種方法則采用反相離子對試劑洗脫[31-35]，結(jié)果表明反相離子對試劑分離效果理想。但使用液相色譜分析植物中磷酸腺苷含量至今鮮有報導(dǎo)。本研究以三乙胺緩沖液代替磷酸鹽緩沖液為流動相”，使ATP、ADP和AMP分離效果更理想。通過以上樣品前處理和分離條件優(yōu)化，成功的將液相色譜分析應(yīng)用于植物煙草中ATP的檢測，為煙草ATP的快速分析和煙草生長過程的深入研究提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（美國Waters公司 Acquity，配有二元溶劑管理器，自動進(jìn)樣器，TUV檢測器和色譜工作站），高速離心機(jī)（德國 Eppendorf 5810R），電子天平（精度0.0001g，METTLER公司AE240），超純水制備系統(tǒng)（德國Millipore公司Milli-Q Reference），pH計（瑞士Mettler Toledo公司SevenMulti），振蕩混合器（上海滬達(dá)儀器設(shè)備有限公司ZD-100）。

5’-三磷酸腺苷鈉鹽（adenosine 5’-triphosphate disodium salt，美國Sigma公司，≥98.5%)、5’-二磷酸腺苷鈉鹽（adenosine 5’-diphosphate sodium salt，美國 Sigma公司，≥95%)、5’-單磷酸腺苷鈉 鹽 (adenosine 5’-monophosphate disodium salt，美國Sigma公司，≥98%)，乙二胺四乙酸二鈉鹽(Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate，美國Sigma公司，99.0～101.0%)、三乙胺(Triethylamine，美國Sigma公司，≥99%)、磷酸（Phosphoric acid，美國Sigma公司，≥85.0%）、氫氧化鉀(Potassium hydroxide，美國Sigma公司，≥85%)、甲醇(Methanol，J.T.Baker公司，色譜純)、高氯酸(Perchloric acid，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，70.0%～72.0%，優(yōu)級純)、苯酚(Phenol，廣東汕頭西隴化工股份有限公司，≥99%，分析純)、氯仿(Trichloromethane，廣東汕頭西隴化工股份有限公司，≥99.0%，分析純)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液及工作液的配制：分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg，用超純水溶解后定容于100mL棕色容量瓶中，配制成1000 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃條件下保存，保質(zhì)期為7天；測定樣品時，按要求配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，混合標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品處理

將采集的新鮮煙葉沿葉脈剖成兩半，稱取5 g樣品，在液氮條件下研磨粉碎并轉(zhuǎn)移到10mL離心管中，按照以下方法進(jìn)行提取。

1.3.1 高氯酸(PCA)提取

于上述裝有樣品的10mL離心管中加入10mL預(yù)冷高氯酸(0.6 M)，在震蕩混合器中快速混合1 min后立即離心10 min(12000 r/min,4℃)，離心后取2mL上清液，置于另外一個5mL離心管中并加入適量預(yù)冷氫氧化鉀(6 M)調(diào)節(jié)pH至6.0～6.5，用流動相(三乙胺緩沖鹽溶液)定容至5mL并搖勻，冷凍離心3 min(12000 r/min,4℃)后取適量上清液并用0.22 μm濾膜過濾，濾液移入樣品瓶中，供UPLC分析。

1.3.2 苯酚(Phenol-TEA)提取

于上述裝有樣品的10mL離心管中加入10mL預(yù)冷TEA-EDTA-飽和苯酚溶液(Phenol-TEA; 0.6% 三乙胺-磷酸,pH 8.0,1 mmol/L EDTA,加入苯酚至飽和。用EDTA螯合鎂或其他二價離子以抑制核苷酸轉(zhuǎn)換酶對磷酸腺苷作用[36])，震蕩混合1 min并冷凍離心10 min(12000 r/min,4℃)，離心后取2mL適量上清液，加入氯仿萃取過量苯酚，震蕩混合1 min，冷凍離心3 min(12000 r/min,4℃)后取適量上清液并用0.22 μm濾膜過濾，濾液移入樣品瓶中，供UPLC分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH-C18(2.1 m×50 mm,1.7 μm); 流動相：甲醇(A)；6 ‰三乙胺水溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH為6.6(B)；柱溫30℃；進(jìn)樣量1 μL；檢測波長259 nm；梯度洗脫條件如表1所示。采用與標(biāo)準(zhǔn)樣對比保留時間定性，外標(biāo)法定量。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Conditions for gradient elution

2 結(jié)果分析

2.1 提取方法的確定

本實驗探討了用高氯酸和苯酚所提取樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果（表2）顯示，苯酚提取樣品ATP和ADP穩(wěn)定性明顯比高氯酸方法略勝一籌。高氯酸法所處理的樣品，在2～3 h之間ADP水解趨勢明顯，3～12 h，ADP變化基本穩(wěn)定；而AMP含量在5 h以內(nèi)平緩增長，這可能由于ATP和ADP水解生成AMP的緣故，5～12 h呈降低趨勢，這說明此時段內(nèi)ATP、ADP水解為AMP速率比不上AMP自身水解速率。苯酚法所處理的樣品，ATP緩慢下降；ADP變化率較為??；AMP則一直呈上升趨勢，由此，初步推斷高氯酸條件下ATP部分可能直接水解為AMP，而苯酚條件下ATP水解更傾向于分步完成，即ATP→ADP→AMP。苯酚法所提取實際樣品在2 h以內(nèi)各磷酸腺苷變化率絕對值小于10%，且AMP在苯酚中不易發(fā)生水解，檢測在2 h以內(nèi)完成測量，也能保證結(jié)果在誤差范圍以內(nèi)；對于3種磷酸腺苷總量(∑adenosine)，在5 h以內(nèi)，該方法所提取實際樣品含量為t0時刻的95.72%，如只是對3種磷酸腺苷總體含量作定量分析，則可放寬在5 h以內(nèi)分析完畢；高氯酸法在2 h內(nèi)磷酸腺苷總量水解率高達(dá)12.07%，所以該方法所提取樣品最好為處理完樣品后立即檢測。

此外，根據(jù)所處理樣品顏色顯示，高氯酸法處理樣品顏色剛開始為黃褐色，2 h以后，樣品顏色逐漸變?yōu)榫G色并加深，而苯酚法所處理樣品顏色較淺，并很長一段時間之內(nèi)外觀上也沒有發(fā)生改變，即苯酚方法提取樣品溶液中的磷酸腺苷較高氯酸法提取的穩(wěn)定。

表2 不同提取方法對樣品中磷酸腺苷的穩(wěn)定性（n=2）Tab.2 Effect of different extract methods on stability of ATP,ADP and AMP (n=2)

分析比較了高氯酸和苯酚提取對煙草中ATP測定結(jié)果的影響（表3）。結(jié)果表明苯酚提取效果與高氯酸相當(dāng)，但用苯酚法節(jié)省了高氯酸法中調(diào)節(jié)pH的步驟，且樣品穩(wěn)定性有所提高。兩種提取方法結(jié)果t檢驗結(jié)果顯示，ATP和ADP測定結(jié)果差異不顯著，AMP存在顯著差異（P＜0.05），苯酚法測定結(jié)果較小，說明苯酚條件下ATP水解更傾向于分步完成。

表3 高氯酸和苯酚提取方法對新鮮煙葉樣品中磷酸腺苷提取效果比較Tab.3 Comparison of ef ficiencies of PCA and Phenol on extraction of adenosine phosphate in fresh tobacco

2.2 色譜條件的優(yōu)化

磷酸腺苷是兩性化合物，結(jié)構(gòu)相似，極性較強(qiáng)，很難在反相色譜柱上保留；使用反相液相色譜分析時多使用磷酸鹽緩沖液或離子對試劑作為流動相對其進(jìn)行分離，前者分離效果往往不理想，峰保留時間過早，常常與樣品中其它雜質(zhì)峰重疊；后者能加強(qiáng)色譜柱對磷酸腺苷保留時間，但反離子對試劑價格高昂，限制了其在一般科研機(jī)構(gòu)的推廣使用。實驗比較了磷酸鹽緩沖液和三乙胺緩沖液作為流動相的分離效果（圖1），結(jié)果表明三乙胺緩沖液作為流動相的分離效果較理想，樣品雜質(zhì)與磷酸腺苷有很好的分離，優(yōu)于普遍使用的磷酸鹽緩沖液。

根據(jù)樣品的實際分離情況對流動相三乙胺鹽溶液濃度和pH值進(jìn)行優(yōu)化，試驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動相濃度為6‰，pH值為6.6時，未知物與樣品中ATP分離情況良好，不影響ATP的準(zhǔn)確定性和定量，實際樣品的分離見圖2。

圖1 磷酸腺苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖：流動相分別為磷酸鹽緩沖液（a）和三乙胺緩沖液（b）Fig.1 Chromatograms of adenosine phosphate standard solution：the mobile phase are phosphate buffer(a) and triethylamine buffer(b)

圖2 新鮮煙葉樣品色譜圖：PCA提?。╟）和苯酚提?。╠）Fig.2 Chromatograms of fresh tobacco samples：extraction of PCA(c) and Phenol(d)

2.3 工作曲線與檢測限

配制濃度為5、10、15、20、25、50、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別對各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行UPLC分析，用ATP色譜峰面積及其濃度進(jìn)行回歸分析。結(jié)果（表4）表明，測定3種磷酸腺苷的線性范圍為5～200 μg/mL，檢測限小于0.5μg/mL，能滿足實際樣品分析需求。

表4 磷酸腺苷的線性關(guān)系、保留時間及檢測限Tab.4 Linearity,retention time and detection limits of adenosine phosphate

2.4 回收率與重復(fù)性

取樣后把實際樣品沿葉脈剖成兩份，分別對高氯酸法和苯酚法進(jìn)行回收率試驗。結(jié)果如表5所示，高氯酸法ATP和ADP回收率較低，與上述ATP在強(qiáng)酸性條件下易水解為其他代謝產(chǎn)物的結(jié)果一致，而苯酚法回收率比較理想，不同添加濃度下，3種磷酸腺苷的回收率為91.68%～110.79%，RSD為1.53%～3.67%之間。

表5 不同萃取方法精密度與回收率比較（n=3）Tab.5 Comparison of recoveries and accuracies between different extraction methods (n=3)

3 結(jié)論

建立了一種高效、便捷和精確的超高效液相色譜測定煙草中磷酸腺苷的方法。采用苯酚法提取，三乙胺緩沖液和甲醇進(jìn)行洗脫，超高效液相色譜法進(jìn)行檢測。3種磷酸腺苷的平均回收率為91.68%～110.79%，RSD＜5%,可用于煙草中提取檢測磷酸腺苷。

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Determination of adenosine phosphate in tobacco leaf by UPLC with phenol-TEA pretreatment

LIN Xiaofeng1,2,WU Yuping1,CHEN Xuejun1,KONG Guanghui1
1 Analysis & Test Center,Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Science,Yuxi 653100,China;
2 Department of Materials Science and Engineering,Yunnan University,Kunming 650091,China

A analytical method for simultaneous determination of adenosine triphosphate (ATP),adenosine diphosphate (ADP) and adenosine monophosphate (AMP) in fresh tobacco leaves was established by ultra high performance liquid chromatography (UPLC)with phenol extraction.ATP,ADP and AMP in phenol extraction were stable and dif ficult to be hydrolyzed with rate of change less than 10% within 2 hours.A better separation of ATP,ADP and AMP was achieved in 10 minutes by utilizing a gradient elution system of 6 ‰triethylamine (pH = 6.6) and methanol as mobile phase.The linear range was between 5～200 μg.mL-1with adenosine concentration and peak area were highly correlated (r＞ 0.9999).The detection limits for ATP,ADP and AMP were 0.5 μg.mL-1,0.4 μg.mL-1,0.3 μg.mL-1respectively,and average recovery rate was 91.68% ～ 110.79% with RSD ranged between 1.53%～3.67%.This method can quickly and accurately detect ATP content in tobacco samples,thus providing important test indicators for the study of energy metabolism,especially tobacco CMS generation mechanism.

UPLC; adenosine phosphate; phenol; fresh tobacco leaves

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.005

TS411

A

1004-5708（2014）01-0026-06

國家煙草專賣局“煙草育種新技術(shù)研究及新一輪優(yōu)質(zhì)抗病烤煙新品種選育”（合同號:110201002001）

林小峰（1989—），在讀碩士，研究方向為儀器分析及材料化學(xué)，Tel：0877-2075072，Email：15807613143@qq.com

吳玉萍(1974—)，碩士，副研究員，研究方向為儀器分析及煙草化學(xué)，Tel：0877-2075072，Email：ypwumm@163.com

2013-07-30