高明春 郝成欣 高志玲 劉大偉 高曉霞 (吉林省白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，白城137000)

特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一種慢性、復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，主要表現(xiàn)為劇烈的瘙癢、明顯的濕疹樣變和皮膚干燥[1]，其發(fā)生發(fā)展過程涉及多種細(xì)胞，如肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及T細(xì)胞等。近年來，隨著對(duì)特應(yīng)性皮炎直接相關(guān)的效應(yīng)細(xì)胞及效應(yīng)分子研究的深入，逐步明確肥大細(xì)胞在特應(yīng)性皮炎炎癥過程中遷移、聚集、局部數(shù)量增多的機(jī)制[2]。眾多研究表明，在AD動(dòng)物模型中，大量肥大細(xì)胞被激活并浸潤(rùn)到皮膚破損處，從而表明了肥大細(xì)胞在AD中的作用[3]。肥大細(xì)胞的激活能產(chǎn)生大量的胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)。研究證明，特應(yīng)性皮炎患者皮損處的角質(zhì)形成細(xì)胞高度表達(dá)TSLP[4]。此外，TSLP還能顯著提高 CD11c+樹突狀細(xì)胞的成熟，從而促進(jìn)幼稚CD4+T細(xì)胞朝Th2細(xì)胞的分化，增強(qiáng)皮膚或全身的Th2反應(yīng)[5]。由于上述過程均與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而大量的研究報(bào)道稱姜黃素具有抗炎及抗氧化活性[6，7]。因此，本研究主要觀察姜黃素在肥大細(xì)胞系HMC-1細(xì)胞中對(duì)TSLP表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)試劑 人肥大細(xì)胞系HMC-1購自于廣州吉妮歐生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的IMDM(美國Gibco公司)培養(yǎng)基(內(nèi)含100 U/ml的青霉素和鏈霉素)。佛波酯(PMA)，A23187及姜黃素購自 Sigma公司。Caspase-1活性檢測(cè)試劑盒購自 R＆D公司。人TSLP抗體、NF-κB p65抗體及細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒購自于碧云天公司。

1.2 TSLP的ELISA檢測(cè) 以每孔4×105個(gè)HMC-1細(xì)胞密度鋪板，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜，經(jīng)0.5～5 μmol/L濃度的姜黃素刺激2 h后，加入PMA與A23187刺激7 h，離心收集上清液，采用夾心ELISA方法來檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的TSLP水平。詳細(xì)步驟可參照說明書。

1.3 TSLP mRNA的定量RT-PCR檢測(cè) 以每孔1×106個(gè)HMC-1細(xì)胞密度鋪板，培養(yǎng)過夜，經(jīng)0.5～5 μmol/L濃度的姜黃素刺激2 h后，加入PMA與A23187僅刺激5 h(mRNA表達(dá)高峰比蛋白出現(xiàn)早)，收集細(xì)胞并采用qRT-PCR法來檢測(cè)TSLP mRNA的表達(dá)。采用Trizol試劑(Invitrogen公司)來提取收集的各組HMC-1細(xì)胞中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(TaKaRa公司)。采用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)對(duì)TSLP mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，β-actin作為內(nèi)參。引物均為上海生物工程有限公司合成，序列如下:人TSLP(上游5'-TGGGTGTCCACGTATGTTCC-3';下游5'-CGGTACTTTTGGTCCCACTCA-3')及人 β-actin(上游 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3';下游5'-CCTTCTGCATCTGTCGGCA-3')，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為197 bp和275 bp。利用ABI PRISM7300快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng):先預(yù)變性95℃ 30 s，然后以95℃ 5 s，60℃ 31 s的條件進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)。采用2-△△Ct法對(duì)TSLP mRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

1.4 NF-κB p65的Western blot檢測(cè) 與ELISA 檢測(cè)TSLP蛋白刺激方法相同，收集各組HMC-1細(xì)胞，用細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白，蛋白濃度采用Bradford方法測(cè)定，蛋白行12%SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上 (北京鼎國生物技術(shù)有限公司)，以含有5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h后，兔抗人 NF-κB p65 一抗(1∶1 000)孵育 4℃ 過夜，二抗(羊抗兔1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯影(碧云天生物技術(shù)有限公司)，曝光。以β-actin作為內(nèi)參。應(yīng)用Bio-Rad成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，半定量分析細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)水平，從而來反映各組NF-κB的活化情況。

1.5 caspase-1活性的檢測(cè) 以每孔5×106個(gè)HMC-1細(xì)胞密度鋪板，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜，經(jīng)0.5～5 μmol/L濃度的姜黃素刺激2 h后，加入PMA與A23187刺激1 h，最后離心收集細(xì)胞。采用caspase-1活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按照說明書操作。主要過程是向收集的細(xì)胞中加入冷的裂解緩沖液，冰上裂解15 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清。然后在每個(gè)裂解上清中加入80 μl的檢測(cè)緩沖液及10 μl的 Ac-YVAD-pNA，37℃下孵育 2 h，最后測(cè)定A405值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用T檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為組間有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)HMC-1細(xì)胞中TSLP因子表達(dá)的影響 通過ELISA方法檢測(cè)刺激上清液中的TSLP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMA聯(lián)合A23187能刺激HMC-1細(xì)胞中TSLP表達(dá)的上調(diào)。而不同濃度的姜黃素均能在一定程度上降低由PMA和A23187誘導(dǎo)的TSLP水平，尤其以50 μmol/L姜黃素最為顯著(見圖1，P＜0.05)，最大的抑制率能達(dá)到(29.5±5.3%)。

2.2 姜黃素對(duì)HMC-1細(xì)胞中TSLP mRNA表達(dá)的影響 通過定量RT-PCR的方法分析TSLP mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMA聯(lián)合A23187能刺激TSLP mRNA表達(dá)的上調(diào)。而不同濃度的姜黃素均能在一定程度上降低由PMA和A23187誘導(dǎo)的TSLP mRNA水平(圖2)，且50 μmol/L姜黃素的抑制效果大于0.5和5 μmol/L(P ＜0.05)。

2.3 姜黃素對(duì)HMC-1細(xì)胞中NF-κB p65活化的影響 通過Western blot來檢測(cè)細(xì)胞核中NF-κB p65的表達(dá)情況，以此來反映姜黃素對(duì)NF-κB p65活化情況的影響。結(jié)果如圖3所示，PMA聯(lián)合A23187能增加NF-κB p65在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，激活HMC-1細(xì)胞中NF-κB活性;而在50 μmol/L姜黃素的作用下，卻降低因 PMA加 A23187誘導(dǎo)的核內(nèi) NF-κB p65的表達(dá)，從而抑制NF-κB活性(P＜0.05)。

2.4 姜黃素對(duì)HMC-1細(xì)胞中caspase-1活性的影響 caspase-1活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，PMA聯(lián)合A23187能在HMC-1細(xì)胞中活化caspase-1，然而，在50 μmol/L姜黃素的作用下，卻顯著地抑制因PMA加A23187誘導(dǎo)的caspase-1活化(P＜0.05)。

圖1 姜黃素對(duì)HMC-1細(xì)胞TSLP表達(dá)的影響Fig．1 Effects of curcumin on the production expression of TSLP in HMC-1 cells

圖2 姜黃素對(duì)HMC-1細(xì)胞TSLP mRNA表達(dá)的影響Fig．2 Effects of curcumin on the expression of TSLP mRNA in HMC-1 cells

圖3 姜黃素對(duì)HMC-1細(xì)胞NF-κB活化的影響Fig．3 Effects of curcumin on the activation of NF-κB in HMC-1 cells

3 討論

姜黃素是一種天然化合物，是我國傳統(tǒng)中藥姜黃根莖中的天然有效成份，現(xiàn)已證明具有一定的抗炎、抗氧化、降血糖、抗腫瘤等活性。本研究主要探討天然化合物姜黃素對(duì)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)表達(dá)的影響。

圖4 姜黃素在HMC-1細(xì)胞中對(duì)caspase-1活化的影響Fig．4 Effects of curcumin on the activation of caspase-1 in HMC-1 cells

PKC激活劑PMA一般是甘油二酯的替代物，而A23187則是一種廣泛被使用的離子載體。相關(guān)研究表明，PMA聯(lián)合A23187能刺激TSLP的產(chǎn)生[8]。此外，在特應(yīng)性皮炎患者皮損處也存在TSLP的高表達(dá)[4]。在本研究中，通過ELISA和RT-PCR方法結(jié)果證實(shí)了姜黃素在蛋白及mRNA水平上均能顯著地抑制由PMA與A23187誘導(dǎo)的TSLP表達(dá)。因此，我們推測(cè)姜黃素對(duì)TSLP升高引發(fā)的特應(yīng)性皮炎等疾病有潛在的治療作用。

NF-κB是一種調(diào)節(jié)參與免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。據(jù)報(bào)道，在各種細(xì)胞中如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞及肥大細(xì)胞中，人TSLP mRNA的表達(dá)均受控于 NF-κB[7，8]。Rafiee 等[9]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在酸化的HET-1A細(xì)胞中能抑制NF-κB的活化，此外，姜黃素還能在小鼠體內(nèi)抑制NF-κB的結(jié)合能力[10]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制NF-κB p65在肥大細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，以此來反映姜黃素抑制 NF-κB 的活性。Kouzaki等[11]報(bào)道，蛋白酶能通過蛋白酶激活受體2(PAR-2)來誘導(dǎo)TSLP產(chǎn)生，因此，我們推測(cè)姜黃素抑制TSLP的表達(dá)，不僅是通過NF-κB途徑，可能還與其他機(jī)制相關(guān)，如PAR-2。

Caspase-1能被多種前炎癥刺激物所激活。本研究發(fā)現(xiàn)在前炎癥刺激物(PMA及A23187)的刺激下，HMC-1細(xì)胞的caspase-1的活性顯著增加。有相關(guān)研究報(bào)道，TSLP的表達(dá)和產(chǎn)生與caspase-1活性相關(guān)[7]。而本研究發(fā)現(xiàn)，在姜黃素的作用下可以抑制因前炎癥刺激物誘導(dǎo)的caspase-1活性。因此，推測(cè)姜黃素抑制肥大細(xì)胞TSLP的表達(dá)和產(chǎn)生，可能是通過阻斷caspase-1活性來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究揭示了姜黃素能在肥大細(xì)胞中抑制由PMA聯(lián)合A23187所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與阻斷caspase-1及NF-κB的活性抑制TSLP的表達(dá)相關(guān)，提示著姜黃素在炎癥治療中有著潛在的應(yīng)用前景。

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