郭 焱 瞿新明 崔健麗 吳澤民 李春莉 金寧一

(長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春130117)

理想的透明帶疫苗應(yīng)該能誘發(fā)足夠的抗體反應(yīng)而不激活病理性的T細(xì)胞反應(yīng)，即能夠誘發(fā)足夠滴度的抗透明帶抗體并產(chǎn)生明顯的避孕效果而又不至于引起卵巢自身免疫疾病，因此制備只含有ZP3 B細(xì)胞表位而不帶人T細(xì)胞表位的肽段，對制備透明帶疫苗至關(guān)重要。本實驗按編碼23～360肽段的人ZP3基因序列，從人ZP3cDNA擴(kuò)增出只含人透明帶B細(xì)胞表位而不帶人T細(xì)胞表位DNA序列，并在此序列前插入tPA信號肽基因，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pIRESI-tPA/ZP3，以此作為核酸疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料 pGEM-T、pIRESIneo質(zhì)粒，DL-2000 Marker購自Promega公司，DH5α等由本實驗室提供。各種限制性內(nèi)切酶、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國 Gibco公司;DNA連接酶購自美國Promega公司;DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen公司、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自 Genscript公司。引物合成及測序由大連寶生物公司完成，

1.2 方法

1.2.1 PCR合成ZP3 B、tPA細(xì)胞表位肽基因 以cDNA為模板，用特異引物擴(kuò)增ZP3B表位基因片段。首先依據(jù)GenBank中ZP3的mRNA的序列設(shè)計合成一對引物:上游引物:5'-GAATTC CAACCCCTCTGGCTCTTGCAGGGT-3'含 EcoRⅠ酶切位點(diǎn);下游引物:5'-CTCGAGGGAAGCAGACCTGGACCA-3'含XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

根據(jù) GenBank(序列號 E00896)上公布的，tPA的序列，利用在線信號肽分析工具預(yù)測tPA信號肽，設(shè)計1對能互為模板直接進(jìn)行擴(kuò)增的特異性引物，通過重疊PCR的方法擴(kuò)增tPA信號肽。上游引物:5'-ACAGCTAGCATGGATGCAATGAAGAGAGGG ctctgctgtgtgctgctgctgtgtgg-3'。下游引物:5'-TTTGGATCCGCTGGGCGAAACGAAGACTGCTccacacagcagcagcacacagcagag-3'。并分別在5'端引入 EcoRⅠ和 BamHⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。PCR合成ZP3 B細(xì)胞表位肽基因和tPA信號肽基因。

1.2.2 重組質(zhì)粒pIRESI-tPA/ZP3的構(gòu)建與鑒定分別將tPA信號肽基因與ZP3 B表位基因BamHⅠ酶切，回收酶切片段，經(jīng) T4 DNA連接酶連接，16℃反應(yīng)過夜。以tPA信號肽基因與ZP3 B細(xì)胞表位基因的連接產(chǎn)物為模板，設(shè)計引物擴(kuò)增目的基因，將膠回收的目的DNA雙酶切后連入相同酶切真核表達(dá)載體pIRESIneo，連接產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α，菌落PCR和酶切鑒定挑選陽性重組子進(jìn)行測序，將測序正確的重組子命名為 pIRESI-tPA/ZP3。

1.2.3 核酸疫苗質(zhì)粒的體外瞬時表達(dá) CHO細(xì)胞株復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的含抗生素的DMEM培養(yǎng)液在37℃，5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天接入150 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞豐度為70%時用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染50 mg的 pIRESIneo、pIRESI-ZP3/tPA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h后收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液。分別將收獲的20 ml培養(yǎng)上清用50 ml Millipore離心管分次離心(3 000 r/min，4℃)至培養(yǎng)上清濃縮到200 μl。

1.2.4 Western blot法檢測HuZP3核心抗原的表達(dá)純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至NC膜上，5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗 GST mAb，4℃ 孵育過夜。PBS-Tween20(PBST)洗膜 4次，每次10 min，再加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG，37℃溫育1 h，PBST和 PBS分別先后洗膜4次后，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，檢測核酸疫苗質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及向細(xì)胞外分泌的情況。

1.2.5 核酸疫苗質(zhì)粒免疫原性分析

1.2.5.1 多克隆抗體的制備 免疫前取尾靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照。以核酸疫苗質(zhì)粒免疫雌性BALB/c小鼠，采用頸前肌肌肉注射，2周后進(jìn)行第1次加強(qiáng)免疫。之后每隔3周加強(qiáng)免疫1次，共免疫4次。于末次免疫1周后脫頸處死小鼠并眼眶取血。分離血清，進(jìn)行純化，制備IgG，分裝置-20℃保存。

1.2.5.2 ELISA檢測核酸疫苗質(zhì)粒免疫活性 將本室純化的ZP3蛋白用抗原稀釋液稀釋至200 ng/ml，并向每孔中加入100 μl，4℃包被過夜。封閉洗滌，加100 μl上述制備的多克隆抗體，在37℃溫育2 h，加入 100 μl羊抗鼠 IgG-HRP(1∶3 000)37℃反應(yīng)2 h，洗滌后加入底物顯色10 min，終止反應(yīng)后測定490 nm的OD值。

2 結(jié)果

2.1 PCR獲取目的DNA序列 以帶有人全長ZP3cDNA的質(zhì)粒pcDNA3.1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果見圖1，圖中可見在約1 000 bp處有單一的特異擴(kuò)增帶，與預(yù)期目的基因片段的分子量(1 000 bp)相符。tPA信號肽基因PCR產(chǎn)物長度為90 bp，以100 bp梯度Marker作對照，PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，在預(yù)期位置出現(xiàn)清晰的目的基因條帶。

2.2 重組質(zhì)粒pIRESI-tPA/ZP3的構(gòu)建與鑒定 將合成的tPA信號肽基因與ZP3 B細(xì)胞表位基因定向插入至同一pIRESIneo載體上(圖2)，PCR鑒定可見特異性目的條帶，同時分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。結(jié)果表明，所見DNA條帶與理論值相符，DNA序列測定顯示，與設(shè)計的已知序列均完全一致，無突變發(fā)生，表明ZP3/tPA被正確插入到載體，核酸疫苗質(zhì)粒 pIRES1-ZP3/tPA構(gòu)建成功 (圖3)。

2.3 攜帶tPA分泌型核酸疫苗質(zhì)粒的體外表達(dá)經(jīng)過 Western blot的驗證，證實了 pIRES1-ZP3/tPA在上清和細(xì)胞裂解液中均高于pIRES1neo(圖4)。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig．1 Amplication of product by PCR

圖2 重組質(zhì)粒pIRES1-ZP3/tPA的構(gòu)建Fig．2 Construction of recombinant plasmid pIRES1-ZP3/tPA

2.4 免疫鼠抗血清效價檢測 采用ELISA法檢測免疫小鼠抗 ZP3抗體，結(jié)果見表 1。免疫 4次后，免疫鼠血清抗ZP3抗體效價明顯高于免疫前的血清對照，說明構(gòu)建的核酸疫苗質(zhì)粒具有很好的免疫原性，可用于研制疫苗。

圖3 pIRES1-ZP3/tPA酶切鑒定Fig．3 Identification of pIRES1-ZP3/tPA with EcoR Ⅰand BamHⅠ

圖4 核酸疫苗ZP3/tPA靶抗原在CHO細(xì)胞中的表達(dá)Fig．4 Expression of target antigen ZP3/tPA encoded by nucleic acid vaccine in CHO cell line

表1 免疫鼠抗血清效價的檢測(n=8)Tab．1 Detection of antiserum titer in mouse(n=8)

3 討論

作為精子初級受體的ZP3具有很強(qiáng)的抗原性，在精卵結(jié)合過程中起著重要的作用。由于抗ZP3抗體可以阻斷精卵的相互作用，ZP3已被認(rèn)為是一種潛在的靶抗原而成為一種理想的不育疫苗[1]。

許多研究已經(jīng)闡明抗ZP3抗體能夠在靈長類包括人體內(nèi)阻斷受精，然而一些實驗卻觀察到其對卵巢生理功能有不同程度的影響[2，3]。本實驗在綜合分析前人研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計和擴(kuò)增了適合在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)人ZP3B細(xì)胞表位的DNA序列，刪除有可能引起卵巢生理功能紊亂的T細(xì)胞表位的DNA序列。

組織纖溶酶原激活物(tPA)信號肽序含有一個KOZARK增強(qiáng)子，可有效促進(jìn)異種蛋白的分泌，提高其誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力[4-6]。

核酸疫苗是近年發(fā)展的一種核酸介導(dǎo)的免疫接種疫苗，其本質(zhì)是當(dāng)含有病原體抗原基因的真核表達(dá)載體被導(dǎo)入機(jī)體后，可被機(jī)體細(xì)胞所攝取并表達(dá)病原體的抗原蛋白，從而誘發(fā)機(jī)體對該蛋白的免疫反應(yīng)。隨著導(dǎo)入途徑和部位的不同可引發(fā)全身或局部的免疫反應(yīng)。在全身性的免疫應(yīng)答反應(yīng)中，既可激活體液免疫，也可誘發(fā)細(xì)胞免疫[7-9]。

載體系統(tǒng)可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)，常用的病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒等;常用的非病毒載體有陽離子脂質(zhì)體和分子耦聯(lián)載體等。由于病毒載體可能有感染、致癌、免疫原性強(qiáng)、操作過程煩瑣等缺點(diǎn);實驗選用非病毒載體系統(tǒng)的代表載體質(zhì)粒pIRES1neo，轉(zhuǎn)染過程操作簡便，省時且經(jīng)濟(jì)，對細(xì)胞類型的運(yùn)用面廣，對轉(zhuǎn)染的核酸類型和分子量有很高的包容性，對細(xì)胞毒性小，也可以用于體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染，因此以質(zhì)粒作為載體在基因工程中得到了越來越廣泛的應(yīng)用[10]。

因此，研究中我們選擇 pIRES1neo為載體，將tPA信號肽與ZP3 B細(xì)胞表位DNA序列插入其多克隆酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了只含人透明帶ZP3B細(xì)胞表位的DNA序列的核酸疫苗質(zhì)粒 pIRES1-ZP3/tPA。構(gòu)建的核酸疫苗質(zhì)粒pIRES1-ZP3/tPA，經(jīng)酶切鑒定及測序表明，與設(shè)計的已知序列均完全一致，表明ZP3/tPA被正確插入到載體質(zhì)粒中，核酸疫苗質(zhì)粒pIRES1-ZP3/tPA構(gòu)建成功。為驗證靶基因是否表達(dá)，我們利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用免疫印跡法測定核酸疫苗質(zhì)粒pIRES1-ZP3/tPA在體外CHO細(xì)胞中的表達(dá)以篩選具有高表達(dá)性的ZP3基因疫苗，并將其免疫實驗小鼠，以酶聯(lián)免疫吸附法驗證其免疫原性，結(jié)果顯示構(gòu)建的核酸疫苗質(zhì)粒pIRES1-ZP3/tPA具有很好的免疫原性，為后續(xù)核酸疫苗質(zhì)粒的鑒定及新型避孕疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

[1]Choudhury S，Kakkar V，Sum an P，et al.Immunogenicity of zona pellucida glycoprotein-3 and spermatozoa YLP12peptides presented on Johnson grass mosaic virus-like particles[J].Vaccine，2009，27(22):2948-2953.

[2]Schu lze K，Goldm ann O，Toppel A，et al.The FAI protein of group C streptococci targets B-cells and exhibits adjuvant activity[J].Vaccine，2012，23(11):1408-1413.

[3]Talay SR，G rammel MP，Chhatwal GS.Structure of a group C streptococcal protein that binds to fibrinogen，album in and immunoglobulin Gvia overlapping modules[J].Biochem J，2009，315(Pt2):577-582.

[4]Clyd esdale G，Pekin J，B eaton S，et al.Contraception in mice immunized with recombinant zona pellucida subunit 3 proteins correlates with Th2 responses and the levels of interleukin 4 expressed by CD4+cells[J].Reproduction，2011，128(6):737-745.

[5]McNeela EA，Mills HG.Manipulating the immune system:humoral versuscel-imediated immunity[J].Adv Drug Deliver Rev，2010，51(1-3):43-54.

[6]Wang JY，Song WT，Li Y，et al.Improved expression of secretory and trimeric proteins in mammalian cells via the introduction of a new trimer motif and a mutant of the tPA signal sequence[J].Appl Microbiol Biotechnol，2011，91(3):731-740.

[7]Yang S，Wang C，F(xiàn)ang X，et al.Fusion of C3d molecule withneutralization epitope(s)of hepatitis E virus enhances antibody avidity maturation and neutralizing activity following DNA immunization[J].Virus Res，2012，151(2):162-169.

[8]Li XW，Lee DK，Chan AS，et al.Sustained expression in mammalian cells with DNA complexed with chitosan nanoparticles[J].Biochim Biophys Acta，2007，1630:7-18.

[9]Bozkir A，Hayta G，Saka OM.Comparison of biodegradable nanoparticles and multiple emulsions(water-in-oil-in-water)containing influenza virus antigen on the in vivo immune response in rats[J].Pharmazie，2004，59:723-725.

[10]Fu ML，Ying SC，Wu M，et al.Regulating effects of novel CpG chitosan nanoparticles on immune responses of mice to porcine paratyphoid vaccines[J].Biomed Environ Sci，2012，19:315-322.