方 成 肖顯杰 萬 卉 丁洪波 劉 立 陳 卓 楊 清 陳慧敏 梅智強

(武漢輕工大學(xué)醫(yī)學(xué)院移植免疫實驗室，武漢430023)

器官移植后繼發(fā)自身免疫反應(yīng)現(xiàn)象已有廣泛報道［1-5］，有些自身免疫抗體水平可作為監(jiān)測移植物病變程度的指標［6-8］。雖然自身免疫反應(yīng)與移植物病變程度有相關(guān)性，但尚未有研究報道移植后繼發(fā)自身免疫的致病性。移植物病變是異體排斥、固有免疫、缺血再灌注損傷等多因素導(dǎo)致的結(jié)果［9-12］，只有先甄別自身免疫效應(yīng)才能獨立檢測其致病性。

使用F344-Lewis大鼠同種腎移植組合，可穩(wěn)定得到慢性移植腎腎病模型［13］。8周后腎功能出現(xiàn)異常，具有移植腎腎病特征性病理改變。對自身組織蛋白vimentin的免疫監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)移植受體發(fā)生了vimentin體液及細胞免疫［14］。本實驗在移植后繼發(fā)自身免疫反應(yīng)的研究基礎(chǔ)上，對其致病性(不限于vimentin免疫)進行研究。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 雄性近交系F344(RT11v1)和Lewis(RT11)大鼠，12～15周齡，體質(zhì)量220～250 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)公司提供(許可證號SCXK京2006-0009)，20℃～24℃/12 h光照條件下標準鼠糧飼養(yǎng)。實驗過程遵循中華人民共和國科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 大鼠腎移植模型及分組 Lewis大鼠左腎被F344大鼠供腎取代，7天后行右側(cè)腎切除術(shù)，受體不使用免疫治療長期存活，建立經(jīng)典慢性移植腎腎病(CAN)模型［13］。改良該模型，保留受體大鼠右側(cè)自體腎;術(shù)后7天探查左側(cè)移植腎，確定血供正常，輸尿管通暢，建立自體腎損害(Autoimmune injury)觀測組(AI組，n=3)。正常Lewis大鼠切除左腎，右側(cè)腎蒂阻斷45 min［15］，建立單純?nèi)毖俟嘧?Ischemia reperfusion)組(IR組，n=3)。在IR組建模程序基礎(chǔ)上，另經(jīng)下腔靜脈輸注同系CAN大鼠脾細胞(5×107個)懸液1 ml，建立自身免疫過繼并自體腎缺血再灌注組(AR組，n=4)。Lewis大鼠自體腎移植(Syngenic transplant)作為對照(Syn組，n=3)。

1.3 脾細胞懸液的制備 無菌收獲大鼠脾臟，將脾臟研磨通過200目不銹鋼濾網(wǎng)。裂解紅細胞后，有核細胞以 PBS清洗2次，細胞重懸于 PBS液［16］。臺盼藍拒染法計數(shù)，活細胞＞95%。脾細胞懸液4℃保存，1 h內(nèi)輸注受體。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 為檢測大鼠血清中的vimentin抗體［14］，先以重組大鼠vimentin蛋白(Cytoskeleton公司)10 μg/ml包埋 ELISA 板4℃過夜，僅加入PBS作為對照孔。洗板并以3%牛血清白蛋白封閉后，加入稀釋大鼠血清樣本(1/25)37℃孵育2 h。洗板后加入HRP標記山羊抗大鼠IgG抗體(Santa Cruze公司)檢測，最終加入底物TMB(碧云天公司)顯色20 min，用iMARK酶標儀(Bio-Rad公司)讀取415 nm吸光度。

1.5 蛋白尿指標檢測 術(shù)后14天開始收集尿液進行腎功能檢測，受體代謝籠內(nèi)禁食可隨意飲水，收集24 h尿液。尿總蛋白濃度(g/L)以考馬斯亮藍法，尿肌酐濃度(mmol/L)以苦味酸法，使用Aeroset全自動生化分析儀(Abbott公司)測定。蛋白尿(Proteinuria)指標依照以下公式計算［16］:蛋白尿(g/mmol)=尿蛋白(g/L)/尿肌酐(mmol/L)。

1.6 腎臟組織學(xué)檢測 大鼠腎臟以4%甲醛固定，石蠟切片行HE染色，腎小球出現(xiàn)毛細血管袢皺縮、塌陷和閉塞為腎小球硬化。根據(jù)硬化面積占單個腎小球比例進行評分，無硬化改變?yōu)?分，硬化面積≤25%、≤50%、≤75%、＞75% 分別計 1、2、3、4 分。隨機觀測25個腎小球，計算平均數(shù)為腎小球硬化指數(shù)(Glomerulosclerosis index，GSI)［17］。

1.7 腎臟IgG抗體沉積檢測 以常規(guī)免疫組化及免疫熒光染色檢測腎臟組織IgG沉積。石蠟切片經(jīng)抗原修復(fù)后，以 HRP標記山羊抗大鼠 IgG抗體(Santa Cruze公司)室溫下孵育30 min，以DAB底物(碧云天公司)顯色。另用Cy3標記山羊抗大鼠IgG抗體(Jackson公司)對腎臟組織染色，熒光顯微鏡下觀測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計分析使用Prism(4.00)軟件。數(shù)值用表示。多組間數(shù)據(jù)比較使用方差分析，輔以指定兩組間秩和檢驗。所有統(tǒng)計分析使用雙側(cè)比較，P＜0.05則差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 血清vimentin抗體水平(圖1) 各組模型第10周收獲血清，檢測vimentin抗體水平。以自體腎移植大鼠(Syn組)血清vimentin抗體水平(0.061±0.012)為對照，單純?nèi)毖俟嘧⒋笫?IR組)的血清vimentin抗體水平(0.064±0.011)無明顯變化。同種腎移植大鼠(AI組)vimentin抗體水平顯著升高(0.312±0.036)。慢性移植腎腎病大鼠的脾細胞輸注同系大鼠后(AR組)，vimentin體液免疫實現(xiàn)過繼，處于升高狀態(tài)(0.310±0.017)。

2.2 蛋白尿指標時間曲線(圖2) 同種腎移植受體保留健腎(AI組)，觀測蛋白尿指標至40 W，未出現(xiàn)持續(xù)腎功能異常。腎臟單純?nèi)毖俟嘧⒔M(IR組)觀測至40W亦無腎功能異常(proteinuria＜0.05 g/mmol)。自免過繼并腎缺灌組(AR組)在第18W蛋白尿水平升高至(0.18±0.03)g/mmol，其后持續(xù)緩慢上升，觀測至第40周為(0.23±0.04)g/mmol，蛋白尿變化具有顯著性。

2.3 腎小球硬化指數(shù) AI組40周時同種移植腎已極度萎縮硬化，同時收獲自體腎未見腎小球硬化(圖3)。IR組40周收獲缺血再灌注腎臟，未見腎小球硬化。AR組40周收獲自體腎，發(fā)生廣泛腎小球硬化(GSI為1.24±0.16)及局部細胞浸潤(圖3)。

圖1 第10周血清vimentin IgG抗體水平Fig.1 The levels of vimentin IgG antibodies in serum at the 10thweeks

圖2 蛋白尿動態(tài)檢測Fig.2 Theproteinuria levelsofthe 3 groupsat different times

圖3 第40周自體腎組織學(xué)檢測(HE)Fig.3 Light microscopie examination of autologous kidney at the 40thweeks(HE)

2.4 腎臟自身抗體IgG沉積檢測 AI組及IR組自體腎未測到IgG沉積，常規(guī)組化及熒光染色為陰性。AR組自體腎廣泛IgG沉積，常規(guī)組化(圖4左)及熒光染色(圖4右)呈強陽性。

圖4 第40周自體腎組織IgG沉積檢測Fig.4 The IgG deposits in autologous kidney of AR group at the 40thweeks

3 討論

有報道器官移植后繼發(fā)自身免疫反應(yīng)，已發(fā)現(xiàn)的人體腎移植后自身反應(yīng)性組織蛋白有agrin、vimentin、Hsp60［18-20］。在實驗?zāi)I移植模型中組織蛋白vimentin自身反應(yīng)性普遍存在［21，22］。大鼠同種腎移植后第4周可檢測到抗vimentin抗體，抗體水平持續(xù)上升，與CAN的加重正相關(guān)［8］。在本實驗室對大鼠同種腎移植及CAN的研究中，不僅發(fā)現(xiàn)了vimentin抗體(高水平)及另一種腎臟組織蛋白megalin抗體(低水平)的持續(xù)存在［14，16］，還檢測到 vimentin反應(yīng)性T細胞。鑒于自身抗體或淋巴細胞并非都具有致病性，腎移植繼發(fā)自身免疫的病理性有待鑒定。由于異體排斥反應(yīng)與自身免疫反應(yīng)在受體的共同存在，以及慢性移植腎腎病的非特異性病理表現(xiàn)，需要設(shè)計實驗甄別繼發(fā)自身免疫導(dǎo)致的移植腎損害。

傳統(tǒng)單側(cè)原位腎移植模型均摘除對側(cè)自體腎［13，16］，本實驗設(shè)計使用了 AI及 AR 兩種改良模型。AR模型中沒有異體MHC抗原，可以除外MHC抗原抗體復(fù)合物的影響。結(jié)果模型AI至40周時同種移植腎已極度萎縮自截，而自體腎功能、病理保持正常。模型AR的自體腎在18周出現(xiàn)功能異常，40周出現(xiàn)腎小球硬化。而單純?nèi)毖俟?IR)模型觀測至40周無不可逆損傷，有報道腎臟缺血再灌注模型觀察至20周未發(fā)生任何纖維化改變［15］。對模型的自體腎作抗體沉積檢測，AI及IR組均未發(fā)現(xiàn)IgG沉積，AR組則出現(xiàn)IgG沉積。以上實驗證明過繼的移植后自身免疫在缺血再灌注損傷基礎(chǔ)上具有病理性，抗原抗體反應(yīng)參與了該自身免疫病理。有理由推斷在異體排斥引起組織損傷基礎(chǔ)上，CAN模型中的繼發(fā)自身免疫可以發(fā)展出致病性。

在前期對F344-Lewis大鼠同種腎移植CAN模型的研究中，也對腎功能進行了持續(xù)監(jiān)測［13］。慢性排斥腎移植組蛋白尿水平在2～6周即升高，維持于(0.15～0.20)g/mmol，術(shù)后8周明顯上升達到(0.42±0.17)g/mmol，第14周時上升至(1.43±0.55)g/mmol，受體已難以存活。本實驗中自身免疫腎功能損害在第18周出現(xiàn)，至40周蛋白尿水平為(0.23±0.04)g/mmol。雖然在40周內(nèi)腎移植繼發(fā)自身免疫導(dǎo)致的腎功能損害強度較低，但已經(jīng)導(dǎo)致廣泛的腎小球硬化及抗體沉積，腎功能損害往往會加速增強［23，24］。除了體液免疫參與移植腎自身免疫損害，在部分自體腎病理檢測中還發(fā)現(xiàn)了局部細胞浸潤。對更長期存活的臨床移植腎，自身免疫損害強度難以忽視。

異體排斥反應(yīng)導(dǎo)致的免疫調(diào)節(jié)異常及自身抗原性質(zhì)的改變，可能使禁忌的自身反應(yīng)淋巴細胞活化，在同種腎移植后引發(fā)自身免疫。雖然該自身免疫可以處于不致病的“生理性自身免疫”狀態(tài)(AI組)，腎單純?nèi)毖俟嘧p傷(IR組)亦未出現(xiàn)慢性損害，但基于腎缺血再灌注損傷該“生理性自身免疫”轉(zhuǎn)變?yōu)榱恕安±硇宰陨砻庖摺?AR組)。其發(fā)生機制可能與損傷相關(guān)分子模式(DAMP)有密切關(guān)系，某些內(nèi)源性的損傷相關(guān)分子如缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)、高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)等［25-27］，應(yīng)激或損傷情況下從細胞內(nèi)釋放，使固有免疫活化并可促進獲得性免疫的發(fā)展。

而vimentin的一些免疫學(xué)特征令人關(guān)注，該蛋白是高度保守的細胞骨架中間纖維蛋白，在腎小球、腎小管及間質(zhì)細胞有豐富表達，分子量約57 kD［28］。近年的研究發(fā)現(xiàn)vimentin在腫瘤發(fā)生中參與細胞的黏附和遷移［29］;前列腺素A1可與vimentin共價結(jié)合，可能通過這種結(jié)合而發(fā)揮抗炎作用［30］。vimentin能在細胞損傷時釋放，如果具有募集趨化能力，或促淋巴細胞活化與分化的能力，則可促進自身免疫的發(fā)展。vimentin可能具有的其他免疫學(xué)特征，將是后續(xù)工作感興趣的內(nèi)容。

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