余宇燕 鄒艷輝 邱亞利 滕海英(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州350122)

石杉堿甲(Huperzine A，HupA)是從石杉科石杉屬植物蛇足石杉［Huperzina serrata(Thumb.)Trev］的酚性部分中提取的一種新型石松類天然生物堿。作為第二代乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)抑制劑，具有高效、高選擇性、可逆性等特點［1，2］。目前石杉堿甲主要用于阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)的治療，可顯著改善記憶功能損傷和行為與心境障礙。國內(nèi)外學(xué)者研究證實，石杉堿甲對血管性癡呆(Vascular dementia，VD)、智力低下、精神分裂癥及重癥肌無力等患者有一定的治療作用［3］。

目前測定 HupA 最常用的方法是色譜法［4，5］，但需要繁瑣的樣品處理步驟、昂貴的儀器以及專業(yè)的操作技能，不適合用于批量樣品的快速篩選和檢測。而免疫分析法具有簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，國外已發(fā)明各種快速檢測試劑盒且技術(shù)成熟，國內(nèi)的免疫分析快速檢測試劑盒技術(shù)研究也逐步發(fā)展。本實驗采用自制石杉堿甲人工抗原［6］免疫實驗動物，獲得具有較高效價和特異性石杉堿甲單克隆抗體，建立間接競爭酶聯(lián)免疫法，研制能快速檢測HupA的間接競爭法酶聯(lián)免疫試劑盒，該方法對儀器設(shè)備和人員操作的要求較低，檢測成本低，能夠滿足對大批量樣品檢測的需要。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 酶標(biāo)儀680(美國Bio-Rad公司);電泳儀、垂直電泳槽(美國 Bio-Rad公司);TGL-16G型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);PHS-3C型精密pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

試驗動物5～6周齡，BALB/c雌性小鼠，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由上海友科生物技術(shù)公司提供。石杉堿甲(純度＞99%，萬邦藥業(yè)有限公司);士的寧、烏頭堿、次烏頭堿、延胡索乙素、小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所);HupA-BSA免疫原(自制);弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鼠源性單克隆抗體亞型檢測試劑盒(美國Sigma公司);Protein G親和層析柱(GE公司);羊抗鼠酶標(biāo)二抗(上海友科生物技術(shù)有限公司);Super-Bradford蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司);石杉堿甲片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號:120301);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 單克隆抗體的制備 用HupA-BSA免疫原與弗氏完全佐劑(弗氏不完全佐劑)等體積乳化后，皮下、肌肉多點免疫BALB/c小鼠，每兩周加強(qiáng)免疫一次，免疫4～6次，檢測其效價。將效價高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇(PEG)下融合，獲得陽性雜交瘤細(xì)胞。加入小鼠腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞與融合細(xì)胞共培養(yǎng)，并篩選陽性株。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到能穩(wěn)定分泌抗石杉堿甲抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)法生產(chǎn)單克隆抗體，將雜交瘤細(xì)胞注入預(yù)先腹腔注射液體石蠟的小鼠腹腔內(nèi)，7～10 d后腹腔下圍穿刺回收腹水。采用辛酸硫酸銨沉淀法、Protein G親和層析法純化抗體，檢測抗體效價和純度［7］。按照Sigma公司鼠源性單克隆抗體亞型檢測試劑盒的步驟對所制備抗體的亞型進(jìn)行鑒定。

1.3 ELISA基本程序 用pH9.6的碳酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋，以 100 μl/孔，4℃過夜;用 PBST(含0.05%Tween 20 的 pH7.2 PBS)洗板 3 次，拍干，加入封閉液，200 μl/孔，37℃ 孵育 2 h;用 PBST洗板3次，拍干，加入用PBST倍比稀釋的抗體100 μl/孔(或不同濃度的石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)溶液及倍比稀釋的抗體各50 μl)，37℃孵育1 h;用 PBST洗板3次，拍干，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)二抗，100 μl/孔，37℃孵育40 min;用PBST洗板3次，拍干;迅速加入新鮮配制的TMB顯色液，100 μl/孔，37℃孵育10～15 min，顯色到一定程度時，及時加入 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，50 μl/孔。靜置 5 min，使反應(yīng)終止徹底、顏色均一。在酶標(biāo)測定儀上，于450 nm測吸光值，以空白孔調(diào)零，測定各孔的OD450值［8］。陰性對照用免疫前的小鼠血清，空白對照為PBS。每一稀釋比的供試品設(shè)置3個平行。

1.4 ELISA方法的確定

1.4.1 最佳抗體的選擇 根據(jù)純化后抗體的效價結(jié)果，選擇OD450值接近1.0的抗體稀釋倍數(shù)作為ELISA工作條件，選擇IC10最低的單克隆抗體作為最佳抗體。

1.4.2 包被抗原和抗體稀釋倍數(shù)的確定 采用方陣滴定法，包被緩沖液梯度稀釋包被抗原后縱向加入酶標(biāo)板，稀釋倍數(shù)分別為 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 000，4℃ 包被過夜;PBST 梯度稀釋抗體后橫向加入酶標(biāo)板，稀釋倍數(shù)分別為1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000、1∶8 000。以倍比稀釋的包被抗原和抗體稀釋液進(jìn)行ELISA檢測，反應(yīng)后比較各組的OD450值，以O(shè)D450值接近1.0時的包被抗原和抗體稀釋倍數(shù)為ELISA最佳工作條件。

1.4.3 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的選擇 按上述確定的最佳反應(yīng)條件，選擇酶標(biāo)二抗的稀釋度為1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000。以 OD450值接近 1.0時的酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為最佳ELISA工作條件。

1.4.4 TMB底物作用時間的選擇 按上述確定的最佳工作反應(yīng)條件進(jìn)行實驗，加入TMB底物反應(yīng)液，分別孵育 5、10、15、20 min顯色，終止。根據(jù)每組陽、陰性的OD450值的比值(P/N)，確定TMB底物的最佳作用時間。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 試劑盒對不同濃度的HupA 標(biāo)準(zhǔn)液(1、5、10、50、100、500、1 000、2 500 ng/ml)進(jìn)行檢測。以HupA標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求出相應(yīng)的相關(guān)指數(shù)和回歸方程。

1.5 HupA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成 試劑盒主要由以下內(nèi)容組成:①HupA-OVA包被的96孔酶標(biāo)板，1塊;②HupA標(biāo)準(zhǔn)液:濃度為0.1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，5 ml/瓶，1 瓶，臨用前配制成 1、5、10、50、100、500、1 000、2 500 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液;③HupAMcAb:含有 0.1～ 1.0 μg/ml的抗體，10 ml/瓶，1瓶;④酶結(jié)合物工作液:HRP標(biāo)記的羊抗鼠稀釋液，10 ml/瓶，1瓶;⑤TMB顯色劑:顯色A(10 mg TMB溶于 10 ml無水乙醇)、B液(檸檬酸 0.51 g;Na2HPO4·12H2O 1.84 g;H2O20.1 ml;高純水 10 ml，混勻)，10 ml/瓶，各 1 瓶;⑥終止液:2 mol/L H2SO4，6 ml/瓶，1 瓶;⑦洗滌液:0.01 mol/L pH7.2～7.4 PBST，200 ml/瓶，1 瓶。試劑盒于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 試劑盒的方法學(xué)考察

1.6.1 靈敏度試驗 隨機(jī)選擇20個孔檢測HupA標(biāo)準(zhǔn)品零含量，X即所得20個孔OD450值的平均值，SD是標(biāo)準(zhǔn)差，檢測限即為X-3SD所對應(yīng)的濃度，進(jìn)行10次標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗。

1.6.2 精密度試驗 依據(jù)已確立的反應(yīng)體系和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，隨機(jī)選擇3塊酶標(biāo)板，每塊抽出5個微孔，測定50 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD450值，計算其平均值和變異系數(shù)。

1.6.3 重復(fù)性試驗 石杉堿甲片樣品溶液:取石杉堿甲片20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于石杉堿甲50 μg)置50 ml容量瓶中。加5 ml甲醇，振搖超聲30 min，加 PBST定容，搖勻。精密量取1 ml置10 ml容量瓶，加PBST定容，作為石杉堿甲片提取液。取石杉堿甲片樣品6份，每份樣品平行5次，測定樣品溶液的OD450值，計算其含量和變異系數(shù)。

1.6.4 保存期測定 在不同時間取試劑盒進(jìn)行檢測其吸光值的變化，以判斷試劑盒的保存期限。

1.6.5 交叉反應(yīng)率 HupA結(jié)構(gòu)復(fù)雜，故采用其與幾種常見生物堿進(jìn)行交叉反應(yīng)率試驗，從而反映其特異性。分別取HupA和其他生物堿(士的寧、烏頭堿、次烏頭堿、延胡索乙素及小檗堿)標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用檢測試劑盒進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線上查出50%OD450值所對應(yīng)的競爭物的濃度即為IC50值。根據(jù)下列公式計算HupA與其他生物堿的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率CR%=IC50HupA/IC50類似物×100%。

1.6.6 回收率試驗 依據(jù)已確立的反應(yīng)體系和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，測定添加了80%、100%、120%3個濃度的石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品的樣品，每個濃度做3份，每份樣品平行3次，計算藥物含量、添加回收率和變異系數(shù)。

1.7 樣品測定

1.7.1 試劑盒測定石杉堿甲片中石杉堿甲的含量

用已研制的試劑盒對石杉堿甲片樣品溶液進(jìn)行檢測，平行測3次，根據(jù)OD450值計算石杉堿甲片中石杉堿甲的含量。

1.7.2 HPLC法測石杉堿甲片中石杉堿甲的含量精密稱取HupA標(biāo)準(zhǔn)品1.01 mg，置于10 ml容量瓶中加入2%酒石酸使溶解，定容，作為對照品貯備液(含HupA 0.101 mg/ml)，并分別稀釋成 1、6、12、18、24 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

HPLC法的色譜條件:日本島津LC-20A型高效液相色譜儀，Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為甲醇 －0.08 mol/L 醋酸銨溶液(30∶70)。設(shè)定流速為0.8 ml/min，檢測波長308 nm，進(jìn)樣量20 μl，柱溫30℃。將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和石杉堿甲片提取液，按上述條件依次上樣。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程式，根據(jù)方程式計算石杉堿甲片中石杉堿甲的含量。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體的制備 融合前3 d對小鼠血清進(jìn)行效價與特異性檢測。選取效價高(＞105)、抑制率好的小鼠進(jìn)行沖擊免疫。取沖擊免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，融合率約為45.2%。ELISA法檢測細(xì)胞上清液，選擇陽性孔再進(jìn)行抗石杉堿甲抗體特異性檢測，選擇抑制率高的孔用有限稀釋法進(jìn)行4次亞克隆，篩選到四株效價與特異性均較好的單克隆細(xì)胞株，命名為3E02、4B01、5D03和4C04。對四株細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，制備腹水并用Protein G親和層析法純化抗體。

2.2 單克隆抗體性質(zhì)鑒定

2.2.1 效價的測定 將純化前的腹水和純化后的抗體以相同的濃度梯度進(jìn)行稀釋，ELISA方法測定效價，結(jié)果3E02、4B01、5D03和4C04純化前的效價分別為 1∶256 000、1∶128 000、1∶128 000 和1∶128 000，純化后的效價為 1∶128 000、1∶32 000、1∶32 000和1∶32 000。純化后的腹水效價較純化前有所下降，可能是在純化時進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯屯肝觯蛊湫r降低。

2.2.2 純度鑒定 腹水經(jīng)Protein G親和層析法純化后，抗體純度較高，抗體二硫鍵斷開后的重鏈分子質(zhì)量約為50 kD，輕鏈分子質(zhì)量約為25 kD，可用于分析相關(guān)特性。

2.2.3 蛋白質(zhì)含量測定 根據(jù) Bradford法檢測Protein G親和層析法純化后的單克隆抗體濃度，其結(jié)果見表1。

2.2.4 免疫球蛋白亞型鑒定 結(jié)果如表2所示:3E02的亞類為 IgG2b、kappa、4B01的亞類為 IgG2b、kappa;5D03的亞類為IgG1、kappa;4C04的亞類為IgG1、lamda。

表1 單克隆抗體純化后蛋白質(zhì)含量Tab.1 Protein content of purified McAb

表2 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果Tab.2 Subclassing test results of anti-melamine McAb

表3 試劑盒保存期試驗結(jié)果Tab.3 Validity of ELISA kits

表4 交叉反應(yīng)試驗Tab.4 Cross reactivity of antibody for compounds

2.3 ELISA最佳工作條件的確定

2.3.1 最佳抗體的選擇 單克隆抗體中3E02、4B01、5D03和4C04的稀釋倍數(shù)分別為1∶8 000、1∶4 000、1∶4 000、1∶2 000，進(jìn)行 ELISA。結(jié)果選擇IC10=5.163最低的5D03為最佳抗體。

2.3.2 包被抗原和抗體稀釋倍數(shù)的確定 采用方陣滴定法進(jìn)行ELISA測定，確定包被抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)，分析表中結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有1∶100(1∶5 000)、1∶200(1∶5 000)、1∶400(1∶4 000)及 1∶800(1∶3 000)的OD450值在1.0左右，綜合各方面原因，選擇包被抗原稀釋倍數(shù)為1∶200，抗體稀釋倍數(shù)為1∶5 000作為最佳工作條件。

2.3.3 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的選擇 通過倍比稀釋的酶標(biāo)二抗進(jìn)行ELISA檢測，比較各組的OD450值，以O(shè)D450值接近1.0時的酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為最佳ELISA工作條件，本試驗選擇酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1∶10 000。

2.3.4 TMB底物作用時間的選擇 對不同的底物作用時間進(jìn)行考察，如比較各組的OD450值，結(jié)果以P/N最大時的TMB底物作用時間為最佳ELISA工作條件，本試驗選擇TMB底物作用時間為15 min。

2.4 ELISA方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以HupA標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率為 Y軸作圖，其中，抑制率=(參照 OD450-待測 OD450)/參照 OD450×100%，得到石杉堿甲的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=0.363x－0.237 7，R=0.992 0，其線性范圍為:5～2 500 ng/ml。

2.4.2 靈敏度試驗 進(jìn)行10次標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗，最終結(jié)果檢測限為6.242 ng/ml。

2.4.3 精密度試驗 隨機(jī)取3塊不同的96孔酶標(biāo)板，變異系數(shù)分別為 1.2%、1.0%、1.2%，結(jié)果在允許范圍之內(nèi)，結(jié)果較為可靠。

2.4.4 重復(fù)性試驗 石杉堿甲片樣品6份的含量平均值為359.103 μg/g和變異系數(shù)為 7.1%，變異系數(shù)在允許范圍之內(nèi)，結(jié)果較為可靠。

2.4.5 保存期試驗 在不同時間取試劑盒進(jìn)行檢測，其吸光值的變化如表3，試劑盒在4℃或－20℃下至少可保存6個月以上。

2.4.6 交叉反應(yīng)率試驗 交叉反應(yīng)率測定結(jié)果見表4，HupA與其他生物堿的交叉反應(yīng)率均小于

0.01%，說明其特異性高。

2.4.7 回收率試驗 石杉堿甲的回收率實驗結(jié)果在94.2%～108.6%之間，變異系數(shù)范圍在2.3%～4.8%之間。結(jié)果表明變異系數(shù)在允許范圍之內(nèi)，方法可行。

2.5 樣品測定

2.5.1 試劑盒測石杉堿甲片中石杉堿甲的含量利用試劑盒對石杉堿甲片提取液進(jìn)行檢測，平行進(jìn)行3次，根據(jù) OD450值，計算石杉堿甲片含量為358.402 μg/g。

2.5.2 HPLC法測石杉堿甲片中石杉堿甲的含量

以濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制HPLC法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=59 171x-40 514，r=0.999 3。根據(jù)回歸方程來計算石杉堿甲片中 HupA 的含量為368.430 μg/g。

3 討論

本試驗利用制備的HupA人工抗原免疫動物，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，獲取HupA的單克隆抗體，建立HupA酶聯(lián)免疫分析法，并制備HupA檢測試劑盒。經(jīng)HPLC法驗證，樣品的試劑盒檢測結(jié)果與HPLC的測定結(jié)果基本一致，本試驗結(jié)果可信，并且靈敏度遠(yuǎn)高于HPLC［9］。因為HupA試劑盒具有樣品前處理簡便，靈敏，經(jīng)濟(jì)，樣品量少，可實現(xiàn)高通量篩選以及可用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，可能成為測定中藥及其制劑中HupA含量的強(qiáng)有力工具，從而對其進(jìn)行質(zhì)量控制和藥理標(biāo)準(zhǔn)化研究。

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