張旭敏，馬曉燁，王小東，姚義安

（同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院 心內(nèi)科，上海200120）

血管平滑細(xì)胞增殖及從中膜向內(nèi)膜遷移是動脈粥樣斑塊演變和支架術(shù)后再狹窄形成的基本過程[1]，其中內(nèi)皮細(xì)胞損傷是再狹窄始動因素[2]，血管平滑肌細(xì)胞的增值、遷移、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)合成降解是病理基礎(chǔ)。已有實驗證實血管壁平滑肌細(xì)胞具有異質(zhì)，當(dāng)血管受到損傷后，釋放炎癥因子誘導(dǎo)血管中層特定種類平滑肌細(xì)胞遷移并聚集在血管內(nèi)膜[3]，增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，并促進(jìn)新生內(nèi)膜形成參與血管重建[4]；血管平滑肌細(xì)胞遷移是動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)以及冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄等臨床常見血管病變共同病理基礎(chǔ)[5，6]，因此對于平滑肌細(xì)胞遷移機制的深入研究對于更好治療血管疾病及預(yù)防冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄有重要意義。

縫隙連接是相鄰的細(xì)胞間進(jìn)行離子及小信號分子傳導(dǎo)交換通道，它幾乎存在于哺乳動物所有組織和細(xì)胞中，每一個通道、連接蛋白都有獨特的成分[7]，血管結(jié)構(gòu)中可檢測4種連接蛋白即：Cx37、Cx40、Cx43和Cx45，其分布主要取決于血管大小、血管樹部位及動物種屬[8]；平滑肌細(xì)胞主要表達(dá)Cx43，有些平滑肌細(xì)胞表達(dá)Cx40，通過這些蛋白完成細(xì)胞間信息溝通[9]。已有實驗觀察到在鼠動脈硬化生長階段血管內(nèi)膜Cx43表達(dá)增加[10]，減少Cx43表達(dá)限制動脈粥樣硬化發(fā)展[11]。但目前有關(guān)Cx43在支架術(shù)后再狹窄中的作用尚不明確。

1 材料與方法

1.1 主要材料 超低溫冰箱（日本SANYO公司）、細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM，美國GIBCO公司）、20%的胎牛血清（FCS，美國GIBCO公司、）PCR儀（Applied Biosystems 7900HT Fast Real－Time PCR System）、投射電鏡 （日本olympus公司）、光鏡（日本olympus公司）、胰酶（Gibco公司）、Cx40、Cx43、S100A4、α－SMA二抗山羊抗兔抗體，action二抗山羊抗小鼠抗體，均為Abcam公司生產(chǎn)，其他試劑均為國產(chǎn)。

1.2 血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)

根據(jù)同濟(jì)大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，將3月齡家豬雌雄不限，動物來源于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動物實驗室，隨機于前降支，回旋支或右冠狀動脈血管置入裸支架一枚（微創(chuàng)Firebird），經(jīng)1月后再次行冠狀動脈造影證實再狹窄的麻醉后處死，取狹窄段冠狀動脈，用冷D－Hanks液沖洗后放在另一玻璃平皿上，用眼科剪沿血管縱向剖開，用手術(shù)刀片背面輕輕刮除內(nèi)皮層，取動脈中膜層，采用組織貼壁法培養(yǎng)冠狀動脈中層平滑肌行原代細(xì)胞培養(yǎng)，正常3月家豬未經(jīng)任何處理為對照組處死，分離冠狀動脈前降支、回旋支、右冠狀動脈，縱形破開分離出中層，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)；2組平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM，美國GIBCO公司）培養(yǎng)，加入20%的胎牛血清（FCS，美國GIBCO公司）放入37℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），逐日倒置顯微鏡觀察，每隔3d換1次液。

1.3 正常冠脈平滑肌細(xì)胞PDGF誘導(dǎo)

經(jīng)原代培養(yǎng)正常冠脈平滑肌細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM，美國GIBCO公司）培養(yǎng)，20%的胎牛血清（FCS，美國GIBCO公司），將貼壁90%細(xì)胞用胰酶消化1min后，依次鋪入六孔板內(nèi)，24h貼壁牢固后，加入 PDGF－BB （10ng／mL，Roche）共同培育，PDGF－BB濃度為10ng／mL[12]，作用24h；電鏡，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化；PCR測定連接蛋白表達(dá)；然后加入連接蛋白阻斷劑（18－a＿glycyrrhetinic acid濃度100μmol／L）[12]，阻斷作用48h，后分別在24h、48h電鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化及連接蛋白變化。實驗分為3組：正常對照組；誘導(dǎo)組：PDGF－BB（10 ng／ml）；阻斷組：PDFG－BB（10ng／ml）＋Cx43阻斷劑（100μmol／L）。各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后收集用于以下各項指標(biāo)檢測。

1.4 光鏡觀察冠脈大體標(biāo)本

冠狀動脈大體標(biāo)本，分為正常及支架組蘇木精－伊紅染色，光鏡觀察血管壁厚度及細(xì)胞形態(tài)。

1.5 電鏡觀察SMC細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)

離心收集貼壁細(xì)胞，2.5%戊二醛固定2－3h，1%娥酸固定2－3h，脫水臨界點干燥，包埋、固化，超薄切片機切片50－60nm，3%醋酸鈾－枸櫞酸鉛雙染色，投射電鏡（日本olympus公司）觀察平滑肌細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)。

1.6 實時熒光定量PCR測定Cx43、Cx40mRNA的表達(dá)

Trizol一步法抽提正常組及支架組冠狀動脈平滑肌細(xì)胞RNA。測定總RNA純度、濃度及RNA完整性的檢測，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及cDNA合成（RT）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。放入熒光定量PCR 儀 （Applied Biosystems 7900HT Fast Real－Time PCR System），反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動進(jìn)行溶解曲線分析，并計算得到每個樣本的ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，計算得到目的基因mRNA的含量。

1.7 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計采用均數(shù)±（SD），應(yīng)用Prism Version 5.0軟件（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA），方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 豬冠狀動脈細(xì)胞原代培養(yǎng)

正常冠狀動脈平滑肌細(xì)胞胰酶消化后分離，光鏡下可見兩種形態(tài)：紡錘型（spindle－shaped，SSMC）和長菱形（rhomboid，R－SMC），紡錘型細(xì)胞呈現(xiàn)谷峰生長模式，長菱形呈單層生長趨勢，同文獻(xiàn)所描述[1]，而在支架植入再狹窄組分離類長菱形為主，見圖1。

圖1 正常R－SMC 正常S－SMC 支架組原代細(xì)胞

2.2 正常冠狀動脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)PDGF誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)

在本實驗中證實誘導(dǎo)豬冠狀動脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變與 Li[13]報道相同。

圖2 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖3 正常組X400 支架組X400

圖4 正常10000X 支架術(shù)后10000X

如圖加入10ng／mLPDGF－BB后，細(xì)胞增殖加速，抑制分化。故誘導(dǎo)組可以看出細(xì)胞核仁復(fù)制分裂，但是細(xì)胞膜分裂還未完成；當(dāng)加入100μmol／LCX43阻斷劑后，又抑制細(xì)胞分裂，見圖2。

2.3 支架植入后

血管內(nèi)膜明顯增厚，光鏡觀察血管中層以RSMC細(xì)胞為主，免疫熒光檢測Cx43表達(dá)明顯增加，見圖3。

透射電鏡下見正常冠狀動脈平滑肌細(xì)胞呈梭狀形態(tài)，核呈鋸齒狀，胞漿內(nèi)含平滑肌細(xì)胞特征性結(jié)構(gòu)肌絲和密體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，游離核糖體豐富，并含有大量高爾基體。支架組的冠狀動脈平滑肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)有大的空泡狀結(jié)構(gòu)，且體內(nèi)也有少量凋亡小體出現(xiàn)，細(xì)胞器線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等相對于正常組數(shù)量減少，見圖4。

2.4 連接蛋白表達(dá)變化

正常冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Cx40表達(dá)為主，Cx43少量表達(dá)，當(dāng)加入PDGF共同培育后可見細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并且細(xì)胞蛋白表達(dá)發(fā)生變化，誘導(dǎo)后以Cx43表達(dá)為主，Cx40少量表達(dá)，與Christos E[14]報道相同。支架植入術(shù)后Cx43表達(dá)增多，見圖5，6。

圖5 PDGF－BB誘導(dǎo)及阻斷Realtime PCR圖

圖6 支架植入術(shù)Realtime PCR圖

3 討論

冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄是血管損傷反應(yīng)引起新生內(nèi)膜增生與血管重塑的過程，正常血管平滑肌位于血管中層，周圍被基質(zhì)所包繞，基質(zhì)與平滑肌接觸從而發(fā)揮生物屏障和機械屏障作用，使平滑肌處于收縮型，限制其移動。在此研究中分離正常豬冠狀動脈平滑肌細(xì)胞，體外顯示兩種不同類型：紡錘型（spindle－shaped，S－SMC）和長菱形（rhomboid，RSMC），以S－SMC占比率較高，R－SMC比率較少。當(dāng)血管損傷后釋放各種細(xì)胞因子、組織因子和炎癥介質(zhì)，在以上因素作用下中膜平滑肌細(xì)胞激活，發(fā)生表型改變，由收縮型變?yōu)楹铣尚?，大量分泌?xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)增加促進(jìn)平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移、增值[12]；血小板源性生長因子（PDGF）是一種炎性因子，它可與細(xì)胞膜上PDGF受體結(jié)合，可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，我們將體外正常組平滑肌細(xì)胞經(jīng)PDGF－BB誘導(dǎo)，使S－SMC變?yōu)镽－SMC，同時伴有Cx43表達(dá)上調(diào)，過反義RNA降低Cx43表達(dá)，這種變化受抑制，S－SMC平滑肌細(xì)胞保持原有形態(tài)，同時表達(dá)a－肌動蛋白。因此，體外證實Cx43表達(dá)與平滑肌細(xì)胞表型及細(xì)胞增殖密切相關(guān)。

本實驗成功制造冠狀動脈支架植入術(shù)后再狹窄模型，狹窄的冠狀動脈，經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜明顯較正常組增厚，在增厚內(nèi)膜可見R－SMC占高比率，SSMC幾乎很少，同時伴大量巨噬細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)RSMC比S－SMC有更強增值、遷移能力，同時與正常組比通過PCR檢測Cx43表達(dá)明顯增加，因此Cx43參與動脈損傷后修復(fù)和再狹窄過程。血管平滑肌細(xì)胞遷移、增值是血管重塑啟動階段重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，是冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄主要原因[15]。

關(guān)于連接蛋白與再狹窄相關(guān)性研究主要涉及平滑肌細(xì)胞，在此研究中觀察豬冠狀動脈平滑肌細(xì)胞表型變化與連接蛋白變化相關(guān)性，我們觀察到細(xì)胞表型與文獻(xiàn)報導(dǎo)人主動脈細(xì)胞類型相類似[16]。我們研究從體外細(xì)胞培養(yǎng)后應(yīng)用PDGF誘導(dǎo)，以及體內(nèi)通過支架再狹窄后細(xì)胞形態(tài)研究均提示連接蛋白Cx43表達(dá)與平滑肌細(xì)胞表型變化和遷移密切相關(guān)。雖然目前機制尚不清楚，但是以連接蛋白Cx43為目標(biāo)靶向治療可能成為預(yù)防再狹窄新起點。

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