羅光成，易婷婷，劉素蘭，張國(guó)元，張 君，蔣興亮

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 南充637000）

二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）是溶解性極好的有機(jī)溶劑之一，既是科研實(shí)驗(yàn)中配制試劑時(shí)的常用助溶劑，也是目前最好的細(xì)胞凍存保護(hù)劑。因此，DMSO在科研實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用非常廣泛，但研究表明DMSO本身對(duì)細(xì)胞也存在一定的毒性作用，可能影響細(xì)胞生長(zhǎng)和功能［1－3］。外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一，是T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的集合體，在機(jī)體免疫反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用。PBMCs參與眾多疾病的的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，特別是HIV、HBV、HCV和結(jié)核等感染性疾病中發(fā)揮著重要作用。因此，在一些疾病的研究過(guò)程中，PBMCs也常常作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，或者被長(zhǎng)期深低溫保存。然而，在科研實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的DMSO是否對(duì)PBMCs的功能產(chǎn)生影響呢？本研將對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

抽取5例健康成年人外周血10ml，密度梯度離心法分離獲取PBMCs。分別在含有0.5%、1%、2%、4%、8%DMSO的培養(yǎng)條件下，檢測(cè)PBMCs的增殖能力和細(xì)胞因子分泌功能。

1.2 主要試劑和儀器

DMSO、PHA、RPMI 1640、淋巴細(xì)胞分離、胎牛血清和牛血清白蛋白購(gòu)自Sigma公司；Anti－CD3和Anti－CD28購(gòu)自BD公司；IFN－γELISPOT試劑盒購(gòu)自BioRad公司；FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司；ELISPOT reader購(gòu)自BIOSYS公司。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞的分離

采集受試者外周靜脈血10ml，并肝素抗凝；用RPMI1640稀釋至20ml；緩緩加到兩支含5ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心2 000rpm×20 min；收集淋巴細(xì)胞分離液上的云霧狀的PBMCs層，并臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，以備后續(xù)試驗(yàn)用。

1.4 CFSE染色檢測(cè)PBMCs增殖能力

以活細(xì)胞熒光標(biāo)記物羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（Carboxyl Fluorescein Diacetate Succinimidyl Ester，CFSE）為細(xì)胞增殖示蹤物，Anti－CD3和 Anti－CD28（Anti－CD3/28）為刺激物，并最終用流式細(xì)胞儀分析PBMCs增殖情況。CFSE染色檢測(cè)細(xì)胞增殖的具體步驟如下：（1）取適量分離到的新鮮PBMCs，用0.1%BSA－PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×107/ml，與等體積4.0μmol/ml的 CFSE混合，37℃避光染色8min。（2）加入等體積的胎牛血清，37℃避光溫育10min，以終止染色反應(yīng)。離心棄上清，再用0.1%BSA－PBS洗滌三次。（3）用含不同濃度DMSO的R10培養(yǎng)基（含90%的RPMI1640和10%的FBS）重懸PBMCs，以2×105的細(xì)胞數(shù)鋪板，并加入刺激物anti－CD3/28，37℃、5%CO2孵育5天。（4）收集細(xì)胞并流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采集到的流式數(shù)據(jù)采用FlowJo分析軟件分析數(shù)據(jù)，其中細(xì)胞增殖強(qiáng)度通過(guò)軟件自帶的增殖分析工具計(jì)算得出，用Divided%表示。

1.5 ELISPOT檢測(cè)PBMCs細(xì)胞因子分泌功能

該實(shí)驗(yàn)以植物血凝素（Phytohaemagglutinin，PHA）為刺激物，采用IFN－γELISPOT技術(shù)檢測(cè)PBMCs細(xì)胞因子分泌功能。具體步驟如下：①包被：用PBS稀釋IFN－γ單克隆抗體（1∶1 000），以50μl/孔加入ELISPOT板的微孔中，4℃冰箱過(guò)夜。②封閉：棄掉微孔中包被液，用無(wú)菌PBS洗滌6次。然后每孔加入200μl R10，室溫封閉60min。③用含不同濃度DMSO的R10將PBMCs重懸PBMCs，并調(diào)至4×106/ml。④棄去封閉液，每培養(yǎng)孔加50μl細(xì)胞懸液和50μl 4μg/ml的PHA，將ELISPOT板于培養(yǎng)箱，37℃5%CO2孵育18－24h，棄培養(yǎng)液并洗滌6次。⑤1∶1000稀釋生物素化的INF－γ多克隆抗體，并每孔加50μl，室溫孵育4h，棄二抗并洗滌6次。⑥1∶1 000稀釋酶標(biāo)親和素，并每孔加50μl，室溫孵育60min，棄酶標(biāo)液并洗滌6次。⑦加顯色液：加入新鮮配制的顯色液100μl/孔，室溫避光顯色15－30min，ELISPOT reader讀板，計(jì)算斑點(diǎn)形成細(xì)胞（spot－forming cells，SFC）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差檢驗(yàn)（least significant difference，LSD），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DMSO對(duì)PBMCs增殖功能的影響

采用CFSE染色示蹤PBMCs、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析增殖細(xì)胞比例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和表1所示，在含有不同濃度DMSO的培養(yǎng)環(huán)境下，PBMCs具有不同的增殖能力。在含有0.5%、1%的DMSO的培養(yǎng)環(huán)境中，與不含DMSO的對(duì)照組相比，PBMCs的增殖能力無(wú)顯著改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而在含有2%、4%、8%DMSO的環(huán)境中，PBMCs的增殖能力受到了明顯的抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 DMSO對(duì)PBMCs細(xì)胞因子分泌能力的影響

采用IFN－γELISPOT技術(shù)檢測(cè)DMSO對(duì)PBMCs分泌IFN－γ的影響，結(jié)果顯示：在含有0.5%、1%、2%的DMSO的培養(yǎng)環(huán)境中，PBMCs的細(xì)胞因子分泌功能無(wú)顯著改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而在含有4%、8%DMSO的環(huán)境中，PBMCs的細(xì)胞因子分泌功能受到了明顯的抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這一結(jié)果表明，高濃度的DMSO同樣對(duì)PBMCs的細(xì)胞因子分泌功能和增殖能力有著相似影響。如圖2和表1所示。

圖1 DMSO對(duì)PBMCs增殖功能的影響

表1 不同濃度DMSO對(duì)PBMCs的增殖和細(xì)胞因子分泌能力的影響

圖2 DMSO對(duì)PBMCs細(xì)胞因子分泌能力的影響

3 討論

DMSO是科研實(shí)驗(yàn)中常用的助溶有機(jī)化合物和最好的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，關(guān)于它對(duì)不同種類細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞毒作用，國(guó)內(nèi)外已有一些報(bào)道［1－5］。已有的研究表明DMSO對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)與細(xì)胞種類、作用濃度和作用時(shí)間明顯相關(guān)。E－ter等［5］人的研究表明，15.5μl/ml的 DMSO 能明顯抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖；Oz等［1］人報(bào)道，1.4μM/ml的DMSO對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性作用；Liu等人［2］的研究結(jié)果顯示，2%的DMSO對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。彭坤等人［4］的研究顯示，10ml/L的DMSO作用48h即可抑制人視網(wǎng)膜色素上皮生長(zhǎng)，其抑制作用隨濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)更加顯著。然而，關(guān)于DMSO對(duì)PBMCs及其細(xì)胞亞群的影響，目前鮮有報(bào)道。在PBMCs的功能研究過(guò)程中，其增殖能力和分泌活性細(xì)胞因子的能力是研究者非常關(guān)心的問(wèn)題。特別是在感染性疾病的研究過(guò)程中，IFN－γ因其作為清除感染的效應(yīng)細(xì)胞因子而廣受關(guān)注。

CFSE是一種用于示蹤細(xì)胞增殖過(guò)程的活細(xì)胞熒光染料，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)來(lái)反應(yīng)細(xì)胞增殖情況。ELISPOT是一種在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子分泌功能的檢測(cè)技術(shù)。目前，CFSE示蹤技術(shù)和ELISPOT技術(shù)分別是檢測(cè)細(xì)胞增值功能和細(xì)胞因子分泌能力的主要方法之一［6－8］。在Anti－CD3/28和PHA的刺激下，淋巴細(xì)胞可分別發(fā)生增殖和分泌細(xì)胞因子。因此，本文采用CFSE示蹤技術(shù)和IFN－γELISPOT技術(shù)，分別檢測(cè)DMSO對(duì)PBMCs增殖能力和細(xì)胞因子分泌功能的影響。我們的研究結(jié)果顯示，DMSO在培養(yǎng)體系中的體積分?jǐn)?shù)為2% 時(shí)，PBMCs的增殖功能開(kāi)始受到明顯抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而當(dāng)培養(yǎng)體系中的DMSO的濃度為4%時(shí)，PBMCs分泌細(xì)胞因子的功能開(kāi)始受到明顯抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且，從圖1A和圖2A可以看出，DMSO對(duì)PBMCs增殖和細(xì)胞因子分泌功能的影響存在良好的濃度依賴趨勢(shì)。這與韓大良、葛成等人的研究結(jié)果相似［3，9，10］，韓大良的結(jié)果表明，當(dāng)DMSO濃度大于2%時(shí)，小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞系細(xì)胞的細(xì)胞活力和活細(xì)胞率受到明顯抑制，并且葛成也證明DMSO濃度大于2%就可以對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的活力產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)。另外，我們的研究的結(jié)果顯示，DMSO對(duì)PBMCs增殖和細(xì)胞因子分泌功能產(chǎn)生抑制作用的起始濃度是不一致的，分別為2%和4%。這表明，DMSO的細(xì)胞毒性作用不僅在不同細(xì)胞種類之間存在差異，即使在同種細(xì)胞的不同檢測(cè)指標(biāo)之間也有所差異。

綜上所述，當(dāng)培養(yǎng)體系中DMSO濃度大于2%，就會(huì)對(duì)PBMC產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用，且其細(xì)胞毒性作用隨濃度的增加而增加。因此，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中含有DMSO時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮DMSO濃度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)時(shí)間等因素，參照已有研究結(jié)果并且進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，采取適當(dāng)措施或減小規(guī)避DMSO對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

［1］Oz ES，Aydemir E，F(xiàn)iskin K.DMSO exhibits similar cytotoxicity effects to thalidomide in mouse breast cancer cells［J］.Oncol Lett，2012，3（4）：927.

［2］Liu CH，Chen LH.Promotion of recombinant macrophage colony stimulating factor production by dimethyl sulfoxide addition in Chinese hamster ovary cells［J］.J Biosci Bioeng，2007，103（1）：45.

［3］韓大良，劉克清，郭少三，等.二甲亞砜、吐溫80對(duì)小鼠骨髓來(lái)源細(xì)胞體外生長(zhǎng)和活力影響的量效關(guān)系分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2008，12（2）：377.

［4］彭 坤，邢怡橋，項(xiàng) 奕，等.二甲基亞砜對(duì)培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的影響［J］.眼科新進(jìn)展，2004（02）：91.

［5］Eter N，Spitznas M.DMSO mimics inhibitory effect of thalidomide on choriocapillary endothelial cell proliferation in culture［J］.Br J Ophthalmol，2002，86（11）：1303.

［6］邱趁麗，張春濤，王佑春，等.ELISpot分析技術(shù)發(fā)展、實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化及應(yīng)用進(jìn)展［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，33（8）：712.

［7］Rehermann B，Naoumov N V.Immunological techniques in viral hepatitis［J］.J Hepatol，2007，46（3）：508.

［8］張 娟，蔣 俊，張 紅，等.結(jié)核分枝桿菌 Ag85A/MPT－64融合基因DNA疫苗的構(gòu)建及免疫研究中ELISPOT技術(shù)的應(yīng)用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16（1）：20.

［9］葛 成，楊連甲，劉寶林.脲和二甲基亞砜對(duì)體外培養(yǎng)鼠成骨細(xì)胞活性和功能的影響［J］.現(xiàn)代康復(fù)，2001（20）：48.

［10］韓 剛，李金龍，賈明庫(kù).CpG ODN誘導(dǎo)人PBMC對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞體外殺傷作用的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（1）：89.