尚修超，顧加祥，張乃臣，劉宏君，田 恒，潘俊博

（1.揚州大學醫(yī)學院，江蘇 揚州225001；2.揚州大學臨床醫(yī)學院 江蘇 揚州225001）

周圍神經(jīng)損傷是臨床常見病癥，損傷后如不進行及時有效的修復，損傷神經(jīng)支配區(qū)肌肉必將萎縮，造成神經(jīng)肌肉功能障礙，給后續(xù)康復帶來不利的影響［1］。膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF），是一種有效的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的分化、發(fā)育、生長和存活具有重要作用［2］。BMSCs經(jīng)GDNF基因誘導后可分化為神經(jīng)細胞，在周圍神經(jīng)損傷模型中可顯著促進損傷神經(jīng)再生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

SD大鼠均由揚州大學醫(yī)學院動物房提供，DAPI福建邁新，HPIAS－1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)，電子天平，冰凍切片機，掃描電鏡，

1.2 建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型

大鼠均用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥位固定。碘伏消毒皮膚，作左大腿切口，約3cm，鈍性分離皮下，沿股后外側(cè)肌間隙鈍性分離到腘窩上緣顯露坐骨神經(jīng)約20mm，輕輕游離，于坐骨神經(jīng)梨狀肌下緣5mm持針器咬合三齒十次，將坐骨神經(jīng)夾傷達透明薄紙狀，8－0普里林顯微縫線標記坐骨神經(jīng)夾傷兩端，大鼠左下肢反應遲鈍，屈伸力量大大減弱，達到造模目的。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，每日肌注適量抗生素。

1.3 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）與腓腸肌濕質(zhì)量恢復率

術(shù)后4周、8周觀察以下指標：①選擇印跡清晰的足印分別測量正常足和傷足三個指標：足跡長度（PL）：足尖到足跟的最大距離；足趾寬度（TS）：第1－5趾的距離；中間足趾寬度（TT）：第2－4趾的距離。②坐骨神經(jīng)指數(shù)（SFI）＝－38.3［（EPLNPL）/NPL］＋109.5［（ETS－NTS）/NTS］］＋13.3［（EIT－NIT）/NIT］－8.8。其中坐骨神經(jīng)指數(shù)值為0～－11%表示神經(jīng)功能完全正常，－100%表示神經(jīng)功能完全喪失，－11%～－100%表示部分神經(jīng)功能恢復。③腓腸肌濕質(zhì)量恢復率（%）＝手術(shù)側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量/對側(cè)正常腓腸肌濕質(zhì)量×100%。

1.4 BMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定

將大鼠置于75%的酒精中消毒5min。無菌條件下取出雙側(cè)脛骨和股骨，并剪去兩端，用5ml注射器抽取DMEN培養(yǎng)基5ml反復沖洗骨髓腔，將沖洗液緩慢置于離心管中，2 500r/min離心20 min，收集中間單層細胞，PBS沖洗2次，應用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基3ml重新懸浮細胞，接種于6孔板內(nèi)，置于室溫、5%CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。24h后更換新培養(yǎng)液去除非貼壁細胞，以后每隔3d換液一次。當1012d時，細胞生長融合達培養(yǎng)板孔90% ，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，3－4d傳代一次。鏡下觀察細胞生長情況。

BMSCs經(jīng)三代體外傳代培養(yǎng)后，接種在無菌的6孔培養(yǎng)板中，達到80%融合時進行BMSCs向神經(jīng)細胞分化的誘導實驗。細胞換液后行載GDNF基因的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)兩周，于室溫、5%CO2、飽和濕度培育箱內(nèi)孵育，每3d全量換液一次，連續(xù)培養(yǎng)。

1.5 BMSCs注入大鼠損傷再生室模型

微量注射器將等量濃縮細胞打入坐骨神經(jīng)再生室模型。對照組：未經(jīng)誘導的BMSCs；實驗組：GDNF基因誘導后的BMSCs。微量注射器注入完成后，將切口縫合，繼續(xù)飼養(yǎng)8周。

1.6 腓腸肌冰凍切片DAPI染色

每組大鼠腓腸肌組織做一套切片，切好的組織粘附于防脫片上，晾干，DAPI染色10min，晾干后，中性樹脂封片，鏡下觀察切片結(jié)果。

1.7 坐骨神經(jīng)再生神經(jīng)纖維分析

坐骨神經(jīng)行Marsland和LFB染色，黑色的軸突和藍色的髓鞘在病理圖文自動分析系統(tǒng)放大600倍下測量各組坐骨神經(jīng)損傷段再生有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目、軸突直徑和再生髓鞘厚度結(jié)果。

1.8 坐骨神經(jīng)切面掃描電鏡觀察

術(shù)后8周取各組坐骨神經(jīng)于損傷標記8－0普里林邊緣切下，2.5%戊二醛固定，用PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃預冷的1% 鋨酸。在4℃固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10min。系列梯度酒精（50%、70% 、80%、90%、100%）脫水，每種濃度酒精通過2次，每次15min。乙酸戊酯：乙醇為1∶1中通過一次30min，純戊酯通過30min，CO2臨界點干燥，粘樣噴金上鏡觀察。

1.9 統(tǒng)計分析

SFI和腓腸肌濕質(zhì)量恢復率結(jié)果采用方差分析，統(tǒng)計軟件采用SPSS15.0。

2 結(jié)果

2.1 腓腸肌濕質(zhì)量恢復率和SFI檢測

術(shù)后4和8周分別測量每組的SFI和腓腸肌濕重恢復率，結(jié)果如下。

表1 術(shù)后各組大鼠腓腸肌濕重恢復率比較（±s，n＝10，%）

表1 術(shù)后各組大鼠腓腸肌濕重恢復率比較（±s，n＝10，%）

＊P0.01， 。

8w對照組術(shù)后4w 術(shù)后27.800±0.128 12.500±0.111實驗組 35.202±0.027＊ 32.600±0.017＊

表2 術(shù)后各組大鼠坐骨神經(jīng)指數(shù)（SFI）比較（±s，n＝10，%）

表2 術(shù)后各組大鼠坐骨神經(jīng)指數(shù)（SFI）比較（±s，n＝10，%）

＊P＜0.01，有顯著差異。

8w對照組術(shù)后4w 術(shù)后－91.46±1.36 －80.24±2.24實驗組 －87.02±1.81 －73.00±2.51＊

圖1 腓腸肌冰凍切片DAPI染色結(jié)果（實驗組）

通過表1可以看出，實驗組可顯著延緩大鼠腓腸肌濕質(zhì)量減少速度，其恢復率情況明顯優(yōu)于對照組，差異有顯著性意義（P＜0.01）。由表2可知，術(shù)后4周四組大鼠SFI恢復情況無明顯差異，但術(shù)后8周，實驗組的SFI恢復情況明顯優(yōu)于對照組，差異有顯著性意義（P＜0.01）。

2.2 腓腸肌冰凍切片DAPI染色結(jié)果

400倍鏡下觀察可見實驗組（圖1）較未誘導對照組（圖2）細胞核更多，而對照組腓腸肌萎縮明顯。

圖2 腓腸肌冰凍切片DAPI染色結(jié)果（對照組）

2.3 坐骨神經(jīng)再生神經(jīng)纖維分析結(jié)果

GDNF基因誘導組與未誘導對照組相比，GDNF基因誘導組再生神經(jīng)纖維計數(shù)、軸突直徑和髓鞘厚度大于未誘導對照組（見表3），差異有顯著性意義（P＜0.01）。

表3 再生神經(jīng)纖維病理圖像分析（±s）

表3 再生神經(jīng)纖維病理圖像分析（±s）

＊P＜0.01

組別 軸突直徑（μm） 髓鞘厚度（μ㎡） 有髓神經(jīng)纖維計數(shù)（根）2.14±0.15 0.99±0.12 65.54±5.01實驗組 3.21±0.08＊ 1.63±0.11＊ 86.54±5.50對照組＊

圖3 坐骨神經(jīng)再生神經(jīng)纖維分析結(jié)果（實驗組）

圖4 坐骨神經(jīng)再生神經(jīng)纖維分析結(jié)果（對照組）

實驗組（圖3）神經(jīng)纖維數(shù)、軸突直徑和髓鞘厚度明顯大于對照組（圖4），且排列更加整齊。

2.4 坐骨神經(jīng)切面掃描電鏡觀察結(jié)果

掃描電鏡下觀察實驗組（圖5）可見明顯高放電神經(jīng)絲交聯(lián)，比對照組（圖6）神經(jīng)再生更加明顯。

3 討論

膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line－derivedneurot rophic factor，GDNF），對多巴胺能神經(jīng)元、運動神經(jīng)元等多種神經(jīng)元均具有促存活及損傷保護作用，對感覺神經(jīng)元有營養(yǎng)作用，因此其可應用于神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的治療［4－7］。

圖5 坐骨神經(jīng)切面掃描電鏡觀察結(jié)果（實驗組）

圖6 坐骨神經(jīng)切面掃描電鏡觀察結(jié)果（對照組）

通過DAPI染色，GDNF基因誘導組較未誘導對照組細胞核更多，并且未誘導對照組腓腸肌萎縮更加明顯。在坐骨神經(jīng)再生神經(jīng)纖維分析中，GDNF基因誘導組坐骨神經(jīng)損傷段再生有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目、軸突直徑和再生髓鞘厚度明顯增加，并且排列比較整齊。掃描電子顯微鏡下，GDNF基因誘導組有明顯高放電神經(jīng)絲交聯(lián)，神經(jīng)再生更加明顯。GDNF基因誘導組可顯著延緩大鼠腓腸肌濕質(zhì)量減少速度。術(shù)后8周，GDNF基因誘導組的SFI恢復情況明顯優(yōu)于對照組。由上述結(jié)果可知，經(jīng)GDNF基因誘導BMSCs組各方面檢測指標均較對照組為好，其中誘導后實驗組掃描電鏡下觀察周圍神經(jīng)再生更加明顯。因此，GDNF基因誘導的間充干細胞對周圍神經(jīng)再生有著顯著的療效。

DAPI是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料，它能粘附在DNA雙螺旋的小溝區(qū)。DAPI作為一種能與DNA分子特異結(jié)合的熒光染料，無明顯細胞毒性，可穿透活細胞胞膜，所以它可用于活細胞和固定細胞的染色。DAPI標記細胞由于操作簡便，被標記細胞的生命活動無明顯影響，可直接觀察，費用低廉，因此得到廣泛使用。DAPI未導致細胞死亡和沒有破壞細胞骨架結(jié)構(gòu)有關(guān)。細胞的彈性模量的變化受各種生理、病理以及外界物理、化學、生物等因子刺激的影響，其中細胞骨架結(jié)構(gòu)動力學變化以及骨架重排對細胞彈性影響最顯著。DAPI穿透活細胞膜與DNA特異結(jié)合沒有影響細胞的骨架結(jié)構(gòu)，所以DAPI染色對細胞的彈性模量沒有影響，同時可通過DAPI的染色初步區(qū)分出細胞核大小。因此，本實驗可見GDNF基因誘導組較未誘導對照組細胞核更多，明顯可見未誘導對照組腓腸肌萎縮明顯。

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow derivedmesenchymal stem cells，BMSCs），是來源于骨髓的單胚層多能干細胞，能自我增殖。因其取材容易，能迅速體外培育和增殖，同時具有多向分化潛能，并且避免了倫理方面的沖突。因此，其在組織工程、細胞移植和基因治療方面有十分廣闊的前景［8－16］。

然而，BMSCs向神經(jīng)細胞的誘導分化過程中仍有一些不足之處［17－26］：①沒有BMSCs的特異性標記分子，而且沒有標準的分離純化、培養(yǎng)擴增和鑒定的方法；②BMSCs可跨胚層分化為神經(jīng)元樣細胞，有望成為神經(jīng)細胞替代治療的種子細胞，但誘導后的細胞是否具有神經(jīng)細胞的生理功能尚待進一步研究；③BMSCs分化為神經(jīng)細胞仍處在實驗研究階段。

同時，在后續(xù)實驗中我們應對BMSCs誘導分化后的神經(jīng)細胞內(nèi)是否含有神經(jīng)遞質(zhì)進行檢測：①該物質(zhì)是否存在于軸突末梢內(nèi)；②神經(jīng)興奮時該物質(zhì)是否能釋放至突觸間隙，并且作用于突觸后膜上的特異性受體；③神經(jīng)元中是否有合成該物質(zhì)的前體和中間物，是否有合成酶和分解酶；④神經(jīng)末梢內(nèi)是否有對該物質(zhì)迅速滅活的機制系統(tǒng)；⑤該物質(zhì)作用于突觸后膜時是否能模擬神經(jīng)生理效應。

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