田忠成，邵飛飛，黨雪菲 ，邱 實(shí)

（吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院 化療科，吉林 吉林132021）

甲狀腺癌為較常見的惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤1%，嚴(yán)重威脅著人類的健康。甲狀腺癌是多因素起源的癌基因和抑癌基因相互失衡導(dǎo)致的疾病。由于甲狀腺腫瘤病程隱匿、進(jìn)展緩慢，一般良、惡性腫瘤的癥狀和體征也沒(méi)有明顯的區(qū)別，給臨床診斷治療帶了極大的困難。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者研究發(fā)現(xiàn)KAI1／CD82與腫瘤進(jìn)程之間密切相關(guān)，可視為新的腫瘤標(biāo)志物。目前KAI1／CD82在甲狀腺癌中的表達(dá)相關(guān)性研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選取吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院2011－2013年甲狀腺癌手術(shù)切除標(biāo)本35例：按組織學(xué)分型隨機(jī)選取乳頭狀腺癌（PTC）10例，濾泡狀癌（FTC）13例，髓樣癌（MTC）12例，另選正常甲狀腺組織12例?；颊咝g(shù)前均未行放療或化療。收集的所有組織均分成兩份，一部分放入10%中性福爾馬林，常溫下固定用于免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)，一部分保存與－80℃冰箱中，用于組織勻漿后進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)。

1.2 試劑與引物 免疫組織化學(xué)染色 免疫組化采用SP法?？筀AI1／CD82人單克隆抗體購(gòu)自Neo marker公司，S－P二抗試劑盒及DAB顯色劑購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 石蠟切片經(jīng)脫蠟和梯度復(fù)水后，將切片置枸櫞酸鹽修復(fù)液中加熱至98℃進(jìn)行修復(fù)；冷卻至40℃以下，滴加3%H2O2室滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，用PBS沖洗；滴加正常兔血清封閉液，室溫孵育30min，甩去多余的液體（勿洗）；滴加鼠抗人KAI1／CD82單克隆抗體，4℃過(guò)夜，PBS沖洗；滴加二抗，室溫孵育20min，PBS沖洗；滴加三抗，室溫孵育20min，PBS沖洗；3，3－二氨基苯聯(lián)胺（DAB）顯色；蘇木素復(fù)染；梯度乙醇脫水、二甲苯透明，樹膠封片。用已知KAI1／CD82陽(yáng)性的甲狀腺癌切片作陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果為陽(yáng)性。用己知KAI1／CD82陰性的乳腺癌切片作陰性對(duì)照，結(jié)果為陰性。用PBS液代替一抗體作空白對(duì)照，結(jié)果為陰性。

1.3.2 RT－PCR 按 Trizol試劑操作說(shuō)明提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照RT反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。KAI1／CD82引物：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度274bp，上游引物：5’－TGGACTTCTACCTGCCCTCA－3’，下游引物：5’－ACACCATTCTCCTGCCTCA－3’，取PCR反應(yīng)液10μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用1D KODAK凝膠圖像分析系統(tǒng)攝片。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 免疫組織化學(xué) KAI1／CD82的陽(yáng)性信號(hào)主要定位于細(xì)胞膜，陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為黃色或棕黃色顆粒，胞漿中亦有著色。200倍顯微鏡下每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中癌細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性癌細(xì)胞數(shù)。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。①染色強(qiáng)度：0分為無(wú)色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②陽(yáng)性細(xì)胞的百分比：1分為陽(yáng)性細(xì)胞≤10%；2分為11%－50%；3分為51%－75%；4分為＞76%。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比的乘積上述2項(xiàng)結(jié)果相乘：0分為陰性（－），1－2分為弱陽(yáng)性（＋），3－6分為中等陽(yáng)性（＋＋），＞6分為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）。

1.4.2 RT－PCR陽(yáng)性條帶判定方法 與 Marker相比較在274bp和616bp處出現(xiàn)陽(yáng)性條帶者分別判定為KAI1／CD82和GAPDH mRNA陽(yáng)性表達(dá)；如在對(duì)應(yīng)區(qū)域未見陽(yáng)性條帶出現(xiàn)，則判定為陰性。用內(nèi)參照（GAPDH）光密度值標(biāo)化KAI1／CD82mRNA的吸光度值，得到KAI1／CD82mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。具體計(jì)算公式如下：KAI1／CD82相對(duì)含量＝（KAI1／CD82光密度值／GAPDH光密度值）×100。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。RT－PCR結(jié)果以1DKODAK凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)灰度值，進(jìn)行半定量分析，判斷差異顯著性，P＜0.05差異有顯著性，P＜0.01差異有非常顯著性意義，P＞0.05差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP法免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在10例甲狀腺乳頭狀癌中，8例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為80%。在13例甲狀腺濾泡癌中，7例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率53.8%。在12例髓樣癌中，2例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為16.7%。而12例正常甲狀腺組織中，12例均表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100%。根據(jù)陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，KAI1／CD82在不同組織學(xué)分型的甲狀腺癌中表達(dá)強(qiáng)度不一樣。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，KAI1／CD82在正常甲狀腺組織中與乳頭狀甲狀腺癌中的表達(dá)相比有所下降但差異不明顯（P＞0.05）。濾泡癌及髓樣癌同正常甲狀腺組織相比，KAI1／CD82表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。在甲狀腺癌中，不同組織學(xué)類型的表達(dá)具有差異，隨著其組織學(xué)惡性度的增強(qiáng)，KAI1／CD82表達(dá)降低（表1）。

表1 KAI1／CD82在正常甲狀腺及甲狀腺癌中的表達(dá)及其與組織學(xué)分型的關(guān)系

2.2 RT－PCR檢測(cè) KAI1／CD82基因RT－PCR目的片段長(zhǎng)度為274bp。電泳結(jié)果顯示，KAI1／CD82基因在所有檢測(cè)的甲狀腺癌及正常甲狀腺癌中具有不同程度的表達(dá)，在274bp處出現(xiàn)亮帶（圖1）。利用Kodak凝膠成像系統(tǒng)軟件分析各條帶灰度值，并計(jì)算目的條帶亮度相對(duì)值。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示KAI1／CD82基因在甲狀腺乳頭狀癌中的相對(duì)表達(dá)值為85.406±12.992，在濾泡癌中的相對(duì)表達(dá)值為70.1±10.880，在髓樣癌中的相對(duì)表達(dá)值為30.682±13.270，而在正常甲狀腺組織中的相對(duì)表達(dá)值為91.124±12.292。乳頭狀癌與正常甲狀腺組織相比，KAI1／CD82的表達(dá)量有所下降，但不顯著。濾泡癌及髓樣癌同正常甲狀腺組織相比，KAI1／CD82表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。隨著甲狀腺癌組織學(xué)惡性度的提高，KAI1／CD82基因表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)（圖2）。

圖1 KAI1／CD82mRNA在正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中的表達(dá)

圖2 KAI1／CD82mRNA在正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中的表達(dá)

3 討論

腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特征之一，也是影響患者生命和治療效果的主要原因。有關(guān)轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究表明，這一個(gè)多階段復(fù)雜過(guò)程的每一階段都受著不同因素的影響及相關(guān)基因的調(diào)控。它們或被激活、或被抑制、相互協(xié)同或拮抗，最終影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。如癌基因的過(guò)度活化、抑癌基因的失活；腫瘤細(xì)胞增殖周期的調(diào)控；腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因素的調(diào)控等等。因此，探討與腫瘤生物學(xué)相關(guān)的因素，尋找腫瘤預(yù)防和治療的有效途徑，是目前腫瘤研究的一項(xiàng)重要課題。

3.1 KAI1／CD82的結(jié)構(gòu)和功能

KAI1／CD82是1995年Dong等從人前列腺癌雜交細(xì)胞中克隆分離出來(lái)的新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，屬于 TM4SF（transmembrane4superfamily）家族成員，能與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)，參與細(xì)胞的增生調(diào)節(jié)[1]。KAI1／CD82基因位于人染色體11P11.2上，該基因全長(zhǎng)約80kb，含8kb的5’區(qū)域、10個(gè)外顯子、9個(gè)內(nèi)含子和外顯子10之后的8kb的DNA序列。編碼區(qū)在外顯子3－10之間，其編碼的蛋白質(zhì)是CD82。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KAI1／CD82是一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。KAI1／CD82在細(xì)胞上可與各種整合素分子、表皮生長(zhǎng)因子受體組成復(fù)合體，通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞的黏附，使腫瘤細(xì)胞不易脫離原發(fā)灶而起抑制轉(zhuǎn)移功能，同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移和在轉(zhuǎn)移部位的增殖有抑制作用，從而實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。

3.2 KAI1／CD82的腫瘤抑制作用

Tomoyuki[2]研究發(fā)現(xiàn)將抑癌基因與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因聯(lián)系起來(lái)。研究結(jié)果表明p53通過(guò)與該區(qū)域結(jié)合從而激活KAI1基因的表達(dá)。由于p53失活在許多腫瘤中存在，常會(huì)減少p53的轉(zhuǎn)錄目的基因KAI1的表達(dá)。Mashimo[3]研究組從基因啟動(dòng)子人手，分析了p53和KAI1／CD82基因表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了p53對(duì)KAI1／CD82基因表達(dá)的正調(diào)控作用，同時(shí)有效證實(shí)了前列腺癌KAI1／CD82陽(yáng)性和p53陽(yáng)性存在的一致性。Tsutomu等[4]發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子－á（TNF－á）通過(guò)核因子－JcB（Nuclearfactor，NFJcB）介導(dǎo)能促進(jìn)KAI1／CEt32的表達(dá)，提示KAI1／CD82的表達(dá)可能與宿主腫瘤的微環(huán)境有關(guān)。Dong等[5]的研究表明，KAI1／CD82蛋白的、上皮細(xì)胞膜定位和廣泛的糖基化，提示KAI1／CD82蛋白參與細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的反應(yīng)，KAI1／CD82蛋白對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用可能與其可調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附作用有關(guān)。在正常前列腺組織及良性增生組織中CD82分子表現(xiàn)為高表達(dá)，且定位于漿膜上間質(zhì)成分不表達(dá)。

3.3 KAI1／CD82的轉(zhuǎn)移抑制作用與腫瘤

KAI1／CD8在人體的許多組織中表達(dá)，在對(duì)食管癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等患者的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)KAI1／CD82的表達(dá)和腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中KAI1／CD82表達(dá)下降提示腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)率增加。Dong等[1]發(fā)現(xiàn)KAI1／CD82在正常前列腺高表達(dá)，轉(zhuǎn)移性人前列腺癌細(xì)胞株中表達(dá)降低或不表達(dá)，認(rèn)為KAI1／CD82的過(guò)表達(dá)可能限制早期前列腺癌的發(fā)展，而它的丟失可能使腫瘤更具有侵襲行為，改變KAI1／CD82的表達(dá)在前列腺癌和與癌相關(guān)的前列腺增生中有改善預(yù)后的重要作用。董良鵬等[6]采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)20例成人正常賁門黏膜正常組和51例賁門癌組織中KAI1／CD82蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KAI1／CD82蛋白在賁門癌組織的表達(dá)與腫瘤的臨床分期浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)，KAI1／CD82在賁門癌組組織中的表達(dá)可作為從分子水平判定人賁門癌組惡性生物學(xué)行為的指標(biāo)。季潤(rùn)元等[7]應(yīng)用組織芯片和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)233例結(jié)直腸癌組織中KAI1／CD82的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KAI1／CD82在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)缺失與腫瘤的分化程度分期密切相關(guān)，有望成為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的新標(biāo)志。汪庚明等[8]應(yīng)用PCR法檢測(cè)5種人鼻咽癌細(xì)胞株、28例鼻咽癌和15例非腫瘤性鼻咽部組織KAI1／CD82mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KAI1／CD82基因在低轉(zhuǎn)移性人鼻咽癌細(xì)胞株中高表達(dá)，而在高轉(zhuǎn)移性人鼻咽癌細(xì)胞株中低表達(dá)。KAI1／CD82基因在鼻咽癌組織中低表達(dá)，在非腫瘤性鼻咽部組織中高表達(dá)，提示該基因在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到一定作用。KAI1／CD82基因在鼻咽癌組織的低表達(dá)與鼻咽部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示該基因在抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起重要作用。武世伍等[9]采用免疫組化ElivisionTMplus法和特殊組織化學(xué)法檢測(cè)160例NSCLC和20例正常肺組織中CD82／KAI1的表達(dá)情況。結(jié)果在正常肺組中CD82／KAI1的表達(dá)率明顯高于NSCLC組織；其水平與腫瘤細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和術(shù)后生存期有關(guān)；Kaplan－Meier生存分析表明CD82／KAI1陽(yáng)性表達(dá)的患者生存率明顯高于陰性者。Yu等[10]報(bào)道KAI1／CD82與膀胱癌的預(yù)后有關(guān)，他們發(fā)現(xiàn)15例KAI1／CD82陽(yáng)性患者的總生存率明顯高于25例KAI1／CD82陰性患者。Mashimo等[11]研究了KAI1與p53的關(guān)系，也觀察了前列腺癌患者的生存率，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)標(biāo)志物缺失使得患者的生存期顯著縮短。

3.4 KAI1／CD82的轉(zhuǎn)移抑制作用與甲狀腺癌

Chen等[12]用 RT－PCR和免疫組化法研究75例甲狀腺癌患者，發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組織中的KAI1／CD82表達(dá)比良性甲狀腺組織中的表達(dá)水平顯著下降，轉(zhuǎn)移性瘤組織中KAI1／CD82的表達(dá)比非轉(zhuǎn)移性瘤組織中的KAI1／CD82的表達(dá)水平顯著下降，KAI1／CD82表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)、臨床分期呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，我們利用免疫組織化學(xué)技術(shù)和RTPCR技術(shù)檢測(cè)了正常甲狀腺組織和不同組織學(xué)類型的甲狀腺癌組織中KAI1／CD82蛋白及mRNA的表達(dá)水平。在正常甲狀腺中，KAI1／CD82具有很高的表達(dá)水平。在甲狀腺癌中的表達(dá)水平較正常甲狀腺降低，并隨著其惡性度的增高而顯著降低。KAI1／CD82在惡性度最高的髓樣癌中，免疫組化法幾乎檢測(cè)不到KAI1／CD82的表達(dá)，提示KAI1／CD82在甲狀腺癌進(jìn)展中的重要作用。綜合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為KAI1／CD82在正常甲狀腺中呈陽(yáng)性表達(dá)，在惡性度高的甲狀腺癌中的表達(dá)水平顯著低于正常甲狀腺組織并隨甲狀腺癌的組織學(xué)惡性度增加而降低。檢測(cè)KAI1／CD82在甲狀腺癌中的表達(dá)情況對(duì)甲狀腺癌的臨床診斷治療具有一定指導(dǎo)作用和意義，可能成為患者預(yù)后推測(cè)的重要指標(biāo)。

[1]Dong JT，Lamb PW，Rinker CW，et al.KAI1，a metastasissuppressor gene for prostate cancer on human chromosome11p11.2[J].Science，1995，268：884.

[2]Tomoyuki M，Misako W，Shigeru H，et al.The expression of KAI1gene，a tumor metastasis suppressor，is directly activated by P53[J].Science，1995，268：884.

[3]Mashimo T，Watabe M，Hirota S，et al.The expression of the KAI1gene，a tumor metastasis suppressor，is directly activated by P53[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（19）：1130.

[4]Tsutomu S，Naoki N，Masaki H.Transduction of KA11／CD82cDNA promotes hematogenous spread of human lung cancer cells in natural killer cell－depleted SCID mice[J].Cancer，2001，94：238.

[5]Dong JT，Suzuki H，Pin SS，et al.Down－regulation of the KAI1 metastsissuppressor gene during the progression of human prostatic cancer infre quently involves gene mutation or allelic loss[J].Cancer Res，1996，56（19）：4387.

[6]董良鵬，陳玲云，秦 雙.P33IG1b和KA11／CD82在賁門癌組織中的表達(dá)及其意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，39（3）：544.

[7]季潤(rùn)元，史恩溢，王永實(shí)，等.結(jié)直腸癌中KAI1／C D 82的表達(dá)及其與臨床病理的聯(lián)系[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，38（1）：33.

[8]汪庚明，郭 卿，徐洪波，等.探討KAI1／CD82基因在鼻咽腫瘤中的意義[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2012，10（4）：502.

[9]武世武，承澤農(nóng)，俞 嵐，等.CD82／KAI1和 HIF－1a在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與血管生成擬態(tài)的關(guān)系[J].中國(guó)肺癌雜志，2011，14（12）：918.

[10]Yu Y，Yang JL，Markovic B，et al.Loss of KAI1messenger RNA expression on both high－grade and invasive human bladder cancers[J].Clin Cancer Res，1997，3（7）：1045.

[11]Mashimo T，Bandyopadhyay S，Goodarzi G，et al.Activation of the tumor metastasis suppressor gene KAI1，by etoposide ismediated by p53and c－Jun genes[J].Biochem Biophys Res Commun，2000；274：370.

[12]Chen Z，Mustafa T，Trojanowicz B，et al.CD82and CD63in thyroid cancer[J].Mol Med，2004，14：517.