張 博，竇逾常，王垂杰

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽110032；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；

3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽110033）

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾主運(yùn)化，為后天之本，氣血生化之源。脾為人體正常生命活動提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，維持人體的內(nèi)外平衡。脾虛是全身性的綜合病理狀態(tài)，與消化系統(tǒng)疾病發(fā)生的關(guān)系最為密切，主要表現(xiàn)為消化系統(tǒng)功能的減退和紊亂等。脾虛狀態(tài)下，腸道黏膜屏障功能紊亂，出現(xiàn)病理性損傷[1]。三葉因子（TFFs，Trefoilfactors）是一族富含半胱氨酸的小分子多肽。其中小腸三葉因子（TFF3或ITF）具有很強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用，能促進(jìn)胃腸黏膜細(xì)胞增殖，還能同胃腸黏液中的糖蛋白結(jié)合、穩(wěn)定黏液屏障，因而在減輕腸道損害，促進(jìn)腸道修復(fù)方面占據(jù)重要地位[2]。四君子湯是臨床上用于脾虛證治療的代表方劑，本研究通過觀察脾虛大鼠腸黏膜TFF3蛋白表達(dá)及TFF3mRNA表達(dá)的變化，及四君子湯對其影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組

SPF級SD大鼠20只，體重250g左右。雌雄各半，分籠，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，即正常對照組、脾虛模型組、自然復(fù)健組和四君子湯組。除正常對照組外，其余3組均制作大鼠長期脾虛模型。① 正常對照組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，生理鹽水4ml／（次·只）灌胃，隔日1次，共7周。②脾虛模型組大鼠小承氣湯（1.5ml／100g）灌胃，當(dāng)日禁食不禁水，隔日1次，同時(shí)隔日足量喂食且游泳至耐力極限1次（以口鼻首次沒入水中為準(zhǔn)），共7周。③自然復(fù)健組喂養(yǎng)方法前4周同脾虛模型組，4周后改為常規(guī)飼養(yǎng)，共7周。④四君子湯組喂養(yǎng)方法前4周同脾虛模型組；4周后改為常規(guī)飼養(yǎng)，同時(shí)用四君子湯灌胃3周，（1.5ml／100g），每日1次。于實(shí)驗(yàn)7周末處死大鼠后取材處理。于實(shí)驗(yàn)7周末處死大鼠，取出3cm回腸黏膜組織，用0.9% 生理鹽水沖洗干凈，冰上刮取腸黏膜，放至內(nèi)－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑

電子天平，JY5002型，0.01g－500g，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。電子天平，BS223S型，0.001g－220g，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有統(tǒng)公司生產(chǎn)。電熱恒溫培養(yǎng)箱，HH·B11·500型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。微量移液器，美國熱電公司生產(chǎn)。PCR儀，BIO－RAD型，美國BIO公司生產(chǎn)。電泳儀，北京六一儀器設(shè)備廠生產(chǎn)。

總RNA 提取試 劑、RT－PCR 試 劑 盒、DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物科技有限公司代為合成。親和純化兔抗大鼠多克隆抗體購自美國santa公司，羊抗兔二抗、蛋白marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。小承氣湯由厚樸、枳實(shí)、大黃（比例3∶3∶2）組成；四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草（比例2∶2∶2∶1）組成，均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，并由該院制劑室制成100%煎劑。

1.3 測定方法

1.3.1 腸黏膜TFF3蛋白表達(dá)的測定

蛋白印跡（Western－Blot）法測定回腸組織中TFF3蛋白表達(dá)的變化：按組織凈重與裂解液1∶10的比例加入蛋白提取試劑，并用玻璃勻漿器在冰上進(jìn)行勻漿，勻漿后靜置于冰上20min，10 000轉(zhuǎn)／分進(jìn)行離心，離心15min，分離上清液即為總蛋白備用。采用考馬斯亮藍(lán)法對各組總蛋白進(jìn)行蛋白定量，每孔上樣20μg總蛋白進(jìn)行電泳，半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，一抗（1∶200）4℃孵育過夜、二抗（1∶2 000）室溫孵育1h，ECL發(fā)光，膠片曝光，掃描膠片，分別測定目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶灰度值，以目的條帶灰度值／內(nèi)參條帶灰度值比值作為統(tǒng)計(jì)量，分析蛋白表達(dá)情況。

1.3.2 TFF3mRNA表達(dá)的測定

采用RT－PCR方法對各組大鼠回腸黏膜組織TFF3mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測：TFF3上游引物5－AGCCCAGGAATTTGTTGGCC－3，下游引物5－TCAAAATGTACATTCTGTCT－3，擴(kuò)增片段長度184bp。以GAPDH做為內(nèi)參，（基因號：X02231），GAPDH 游 引 物 為 5′GCTGGTGCTGAGTATGTCGT，下游引物5′GAATGGGAGTTGCTGTTGAA，擴(kuò)增片段長度608bp。凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，并測定目的基因條帶和內(nèi)參基因條帶的積分光密度值，以目的條帶積分光密度值／內(nèi)參基因積分光密度值的比值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，進(jìn)行TFF3mRNA表達(dá)水平分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所測得數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與空白對照組相比，脾虛各組腸組織中TFF3蛋白的表達(dá)均有下降，其中四君子湯組TFF3蛋白的表達(dá)高于自然復(fù)健組及脾虛模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠回腸組織中TFF3蛋白的表達(dá)

2.2 與空白對照組相比，脾虛各組腸組織中TFF3 mRNA的表達(dá)均下降，其中四君子湯組TFF3mRNA的表達(dá)優(yōu)于自然復(fù)健組及長期脾虛模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。見表2，圖1。

表2 各組大鼠回腸組織中TFF3mRNA的表達(dá)

圖1 各組大鼠回腸組織中TFF3mRNA的表達(dá)

3 討論

腸三葉因子（TFF3或ITF intestinal trefoil factor）是三葉肽家族成員之一，由腸黏膜上皮杯狀細(xì)胞分泌，廣泛存在于胃腸道，與MUC2等在腸黏膜中相互鏈接，在黏膜中構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，抵抗胃腸道酸流，蛋白酶降解和機(jī)械損傷，從而保護(hù)腸黏膜免受損害[3]。同時(shí)，TFF3可以驅(qū)動受損黏膜周圍完好的上皮細(xì)胞向黏膜損傷表面遷移覆蓋，加速損傷修復(fù)，且TFF3較EGF引起的細(xì)胞遷徙，能減少細(xì)胞間隙的產(chǎn)生，更能精密修復(fù)黏膜損傷部位[4]，保持腸黏膜完整。TFF3能促進(jìn)NF－κB的活性，從而增強(qiáng)ICE－18細(xì)胞的抗凋亡能力；而PI3－K／Akt途徑促進(jìn)了TFF3和MUC2在小腸上皮細(xì)胞的表達(dá)，TFF3又能反過激活PI3－K／Akt途徑，以此來下調(diào)Caspase－3／9的活性[5]。研究表明，TFF3在抑制腸道黏膜凋亡、杯狀細(xì)胞的分化中也起著重要作用，從而對黏膜起到保護(hù)作用。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，TFF3可能通過促進(jìn)環(huán)氧化酶－2合成，繼而促進(jìn)前列腺素－2生成，從而避免氧化應(yīng)激對上皮細(xì)胞的損傷，來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[6]。借助Scr和激活STAT3誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，有助于細(xì)胞的重建[7]。TFF3被認(rèn)為是內(nèi)源性具有抗凋亡特性的肽類物質(zhì)，在腸道的自我保護(hù)和損傷后修復(fù)中占有重要地位。

脾虛證大鼠出現(xiàn)胃腸黏膜上皮局灶壞死脫落，炎性滲出，胃腺、腸腺萎縮，腸黏膜上皮壞死脫落。上皮細(xì)胞內(nèi)含有大量自噬泡，腺體萎縮。黏膜下層水腫，細(xì)胞排列疏松。腸黏膜微絨毛排列稀疏紊亂，長短不一[8]。黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量均顯著增加，絨毛頂端與黏膜下層TLR2表達(dá)量均顯著降低[9]。證明脾虛大鼠腸黏膜存在病理器質(zhì)性損傷，進(jìn)而可能引起腸黏膜功能損害。

本文觀察到與空白對照組相比，脾虛各組大鼠腸黏膜TFF3蛋白表達(dá)及TFF3mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，這提示脾虛狀態(tài)下大鼠腸黏膜病理器質(zhì)性損傷，防御能力減弱。四君子湯組經(jīng)治療后TFF3蛋白表達(dá)及TFF3mRNA表達(dá)明顯增加，優(yōu)于自然復(fù)健組及長期脾虛模型組，提示四君子湯可增強(qiáng)TFF3mRNA與蛋白的表達(dá)，這一結(jié)果也表明四君子湯能夠促進(jìn)受損腸黏膜細(xì)胞的修復(fù)，增強(qiáng)腸黏膜防御能力。從而對腸黏膜屏障發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

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