沈青春,王 芳,張純萍,高和義,宋 立,李聰研,魏晶晶,宋蕭婷,蘇 鵬,寧宜寶?
(1.北京中海生物科技有限公司,北京100081;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)
重組DNA技術(shù)和發(fā)酵工程的快速發(fā)展和結(jié)合,使得大量制備某種特定蛋白成為可能。大腸桿菌和酵母菌是當(dāng)前表達外源蛋白的兩種常用宿主細(xì)胞,高細(xì)胞密度發(fā)酵(high cell density cultivation,HCDC)是指在一定條件和培養(yǎng)體系下,使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高,從而更多地或更高效地獲得目的產(chǎn)物的發(fā)酵技術(shù),其在工業(yè)化上的應(yīng)用帶來的經(jīng)濟效益十分顯著[1-2]。
影響發(fā)酵過程的因素很多,包括培養(yǎng)基組成、pH、溫度、裝液量、接種量、種齡、攪拌與通氣等條件,而這些條件通常并不獨立影響發(fā)酵過程,而是存在交互作用。發(fā)酵工藝的優(yōu)化就是將影響過程的所有關(guān)鍵因素達到最佳值,從而使產(chǎn)率最大化,一般步驟包括:影響因子的確認(rèn);確定各影響因子的影響程度并篩選因子;根據(jù)試驗?zāi)康暮陀绊懸蜃佑绊懗潭?,確定優(yōu)化方案進行試驗;對實驗結(jié)果進行數(shù)學(xué)統(tǒng)計分析,確定其最佳條件;最后對最佳條件進行驗證[3-4]。
隨著統(tǒng)計學(xué)和計算機應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展,新的優(yōu)化方法不斷涌現(xiàn),但總體上可分為非統(tǒng)計學(xué)優(yōu)化技術(shù)和統(tǒng)計學(xué)優(yōu)化技術(shù)兩類。非統(tǒng)計學(xué)優(yōu)化技術(shù),即傳統(tǒng)的單次單因子法(One Factor at One Time),每次只改變一個因子而其它因子保持不變,優(yōu)化方法直觀有效。統(tǒng)計學(xué)優(yōu)化技術(shù)是利用統(tǒng)計學(xué)原理對多個因素進行試驗設(shè)計,再對結(jié)果進行統(tǒng)計分析得到最佳配比,主要方法包括響應(yīng)面法[5-6]、最陡爬坡法[7-8](Steepest Ascent)、進化操作法[9](Evolutionary Operation)、典型分析法[10](Canonical Analysis)、Gauss-Seidel法、Nelder-Mead單純形法等,其中響應(yīng)面法是近年來應(yīng)用最多的一種優(yōu)化技術(shù)[11]。該方法是1951年Bos-Wilson研究用于化學(xué)過程因子優(yōu)化的一種綜合性方法,其基本原理是用數(shù)學(xué)模型來描述實驗的影響因子與目標(biāo)響應(yīng)值間的關(guān)系,并以此為據(jù),確定在目標(biāo)響應(yīng)值達到最高或最低時各因子的最佳條件。該方法能在有限實驗次數(shù)下,確定各因子對目標(biāo)響應(yīng)值的影響,探清其交互作用的程度,最后求得其最優(yōu)化條件[12-13]。
大腸桿菌DE-pET-P46是可以高效表達豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的 P46蛋白的重組基因工程菌。Mhp是引起豬地方流行性肺炎(Swine Enzootic Pneumoniae of Swine,EPS)的一種病原微生物,其P46蛋白是其獨有的種特異性蛋白。將P46基因親水區(qū)克隆到pET28a(+)質(zhì)粒上,再轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌得到重組大腸桿菌DE-pET-P46,通過IPTG誘導(dǎo)可實現(xiàn)重組蛋白rP46的高效表達[14]。本研究擬以重組大腸桿菌DE-pET-P46為例,主要針對培養(yǎng)基進行優(yōu)化,以期望得到一種可以在生物反應(yīng)器中實現(xiàn)重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的培養(yǎng)基配方。試驗首先對各類營養(yǎng)成分進行考察并確定哪些為影響因子,再采用響應(yīng)面法設(shè)計并進行實驗,使用SAS統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,確定各營養(yǎng)成分的最佳配比,以實現(xiàn)當(dāng)前實驗室培養(yǎng)條件下大腸桿菌重組菌培養(yǎng)密度的顯著提高,并初步探索使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)所能達到的菌體濃度及其對重組菌的表達是否存在影響。
1.1 材料
1.1.1 菌種 重組大腸桿菌DE-pET-P46由本實驗室構(gòu)建并保存。
1.1.2 主要儀器 恒溫?fù)u床(上海蘇坤SYY-200B)、電子分析天平(賽多利斯 AL104)、紫外分光光度計(BENKMAN公司UV-800型)、臺式高速冷凍離心機(Sigma 3K-18)、生物反應(yīng)器(NBS Bioflo410型)。
1.1.3 主要試劑 蛋白胨、酵母粉購自GIBICO公司;葡萄糖、蔗糖、乳糖及無機鹽等購自北京化學(xué)試劑公司。
1.2 方法
1.2.1 重組菌培養(yǎng)和光密度測定 將新轉(zhuǎn)化的DE3-pET-p46菌挑單菌落,接入20 mL LB(Kan+)培養(yǎng)基中37℃ 200 r/min振搖培養(yǎng)18~20 h后作為試驗用菌種。按照0.5%的接種量將新轉(zhuǎn)化的DE3-pET-p46菌液接入3個裝有50 mL試驗發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后,取3個重復(fù)樣品,分別測定其光密度A600值或濕菌重,計算平均值。
1.2.2 培養(yǎng)基成分的確定
1.2.2.1 25%酵母浸出液和酵母粉對比試驗 使用25%酵母浸出液替代LB培養(yǎng)基中的酵母粉成分配制培養(yǎng)基,分別按5%、10%、、15%、20%、30%的比例設(shè)立6個梯度配制培養(yǎng)基,其他成分不變,并設(shè)普通LB培養(yǎng)基作為對照,按照1.2.1的方法培養(yǎng)和測定DE-pET-P46重組菌,以確定最佳的添加濃度。
1.2.2.2 緩沖系統(tǒng)的選擇 根據(jù)25%酵母浸出液和酵母粉對比試驗結(jié)果,將使用酵母浸出液的LB培養(yǎng)基,分別使用鉀離子磷酸鹽和鈉離子磷酸鹽以及二者搭配組成pH緩沖系統(tǒng),按照以下配方配制培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基 1(g/L):蛋白胨 10.0 g、25%酵母浸出液 100 mL、葡萄糖 5.0 g、K2HPO4·3H2O 18.0 g,KH2PO43.0 g,即鉀鹽緩沖體系培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基 2(g/L):蛋白胨 10.0 g、25%酵母浸出液 100 mL、葡萄糖 5.0 g、Na2HPO4·12H2O 12.0 g,NaH2PO4·2H2O 2.0 g,即鈉鹽緩沖體系培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基 3(g/L):蛋白胨 10.0 g、25%酵母浸出液100 mL、葡萄糖 5.0 g、Na2HPO4·12H2O 16.5 g,KH2PO41.5 g,即鈉鹽緩沖體系培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基 4(g/L):蛋白胨 10.0 g、25%酵母浸出液100 mL、葡萄糖 5.0 g、NaCl 10.0。
以上4種培養(yǎng)基分別調(diào)pH至7.2后,116℃30 min高壓滅菌,按照1.2.1的方法培養(yǎng)和檢測DE-pET-P46重組菌。
1.2.2.3 能量組分的優(yōu)化 在培養(yǎng)基1配方中,對葡萄糖的濃度進行優(yōu)化和替換,分別加入葡萄糖、蔗糖和乳糖至終濃度5 g/L。根據(jù)以上實驗結(jié)果設(shè)計培養(yǎng)基配方,培養(yǎng)16 h后測定其細(xì)胞密度A600值。
1.2.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化 根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理,設(shè)計了四因素三水平的響應(yīng)面分析(RSA)試驗,共有 27 個試驗[5,11-13]。 本實驗為了簡便起見,省去第一步直接選用蛋白胨(X1)、25%酵母浸出液(X2)、蔗糖(X3)、10×鉀離子平衡鹽(X4)4個因素為自變量,以培養(yǎng)物菌體密度為響應(yīng)值。試驗因素與水平的選取見表1。
表1 試驗1 Box-Behnken設(shè)計的因素與水平取值表
對27個試驗進行實驗,將每組實驗吸光值A(chǔ)600的測定結(jié)果作為反應(yīng)值,使用SAS軟件對其進行響應(yīng)面分析,得到反應(yīng)值的回歸方程,通過求一階偏導(dǎo)數(shù)得到各因素的最佳值和對應(yīng)的最高反應(yīng)值。
根據(jù)試驗1的優(yōu)化結(jié)果進行二次優(yōu)化,由于25%酵母浸出液最佳添加量可能很大,不符合降低成本的要求,將其固定在10%,重新引入酵母浸出粉,考慮到蛋白胨與25%酵母浸出液的互作關(guān)系極顯著(X1?X2的P值小于0.01),新設(shè)計的試驗包括3個因素,即蛋白胨、酵母浸出粉和蔗糖,見表2。
表2 試驗2 Box-Behnken設(shè)計的因素與水平取值表
對三因素三水平試驗設(shè)計,共需15個試驗,反應(yīng)值為每組的吸光值A(chǔ)600測定結(jié)果,使用SAS軟件對其進行響應(yīng)面分析,得到反應(yīng)值的回歸方程,通過求一階偏導(dǎo)數(shù)得到各因素的最佳值和對應(yīng)的最高反應(yīng)值。
1.2.4 優(yōu)化后培養(yǎng)基的驗證 為試驗?zāi)P偷臏?zhǔn)確性,按照優(yōu)化的培養(yǎng)基配方配制5瓶100 mL培養(yǎng)基,37℃振搖培養(yǎng)16~18 h后收獲,測定其細(xì)胞密度值A(chǔ)600和濕菌重。
1.2.5 生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)初步試驗 按照優(yōu)化的培養(yǎng)基配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基,使用NBS Bioflo 410型生物反應(yīng)器(最大容積14 L)進行發(fā)酵,接種量0.5%,發(fā)酵總體積8 L,反應(yīng)溫度37℃,溶氧控制20%,使用20%葡萄糖和氨水維持pH 6.4~7.6,反應(yīng)24 h加入IPTG誘導(dǎo),32 h收獲。將收獲的菌液進行A600測定細(xì)胞密度,算出每毫升菌體濕重。將收獲的菌體洗滌、裂解、離心提取包涵體,使用SDS-PAGE檢測,比較其與通過振搖培養(yǎng)的DE-pET-P46重組菌間是否存在差別。
2.1 培養(yǎng)基成分確定 以不同濃度25%酵母浸出液替代LB液體培養(yǎng)基中酵母粉,對基因重組菌培養(yǎng)效果的影響見圖1??梢钥闯觯褂媒湍附鲆禾鎿QLB中酵母粉可明顯增加大腸桿菌的細(xì)胞濃度,隨著酵母浸出液的量增加,細(xì)胞濃度先增加后下降,最佳添加量為10%。
圖1 不同比例的25%酵母浸出液替換LB中酵母粉對大腸桿菌重組菌生長的影響
在改良的LB培養(yǎng)基中引入鉀鹽或鈉鹽緩沖系統(tǒng),其培養(yǎng)效果如圖2??梢钥闯觯肓姿猁}緩沖體系能顯著改善培養(yǎng)基的大腸桿菌培養(yǎng)濃度,其中培養(yǎng)基1(磷酸鉀鹽緩沖體系)好于磷酸鈉鹽及鉀鈉混合緩沖體系,培養(yǎng)基1、2、3均好于無緩沖體系的培養(yǎng)基4。
圖2 引入緩沖系統(tǒng)后的改良培養(yǎng)基對大腸桿菌重組菌生長的影響
在培養(yǎng)基1的基礎(chǔ)上,分別使用5 g蔗糖或乳糖替代葡萄糖,以比較3種糖作為碳源對重組菌培養(yǎng)密度的影響,結(jié)果如圖3。結(jié)果表明,培養(yǎng)基中加入3種糖對培養(yǎng)效果沒有明顯區(qū)別,但從生產(chǎn)的角度上講,蔗糖最經(jīng)濟。
圖3 使用葡萄糖、蔗糖和乳糖作為碳源的改良培養(yǎng)基對大腸桿菌重組菌生長的影響
2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理,設(shè)計的四因素三水平的響應(yīng)面分析(RSA)試驗,共有27個試驗的相應(yīng)值(A600)的測定結(jié)果見表3。
表3 優(yōu)化試驗1響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果
通過SAS的響應(yīng)面回歸(RSREG)進行數(shù)據(jù)分析,建立二次響應(yīng)面回歸模型,并進而尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平。經(jīng)整理后所得的分析結(jié)果如表4。
表4 二次多項回歸模型方程方差分析
四個因素中X1、X2的P值僅為0.001,也均遠小于0.01,表明 X1(蛋白胨)和 X2(25%酵母浸出液)對反應(yīng)值Y(A600)的影響極顯著;X3的P值為0.105,大于 0.05,表明 X3(蔗糖)對反應(yīng)值Y(A600)有一定的影響,但不顯著;X4的P值為0.603,表明X4(10×鉀鹽平衡鹽濃度)對反應(yīng)值 Y(A600)的影響不明顯;X1?X2的P值也僅為0.001,表明 X1(蛋白胨)和X2(25%酵母浸出液)相互間影響極顯著。
二次項和交互項的P值也均遠小于0.01,說明二次項和交互項的擬合程度很好。
使用SAS軟件對上述試驗結(jié)果作RSREG多元回歸分析,得出以 Y為因變量,X1、X2、X3、X4為自變量的四元二次回歸方程,對其求極值,得出Y的最大值為1.91,對應(yīng)各因素的值的位點分別為X1=-0.825,X2=1,X3=-1,X4=0.406,轉(zhuǎn)換成培養(yǎng)基成分即為蛋白胨 8.6 g/L、25%酵母浸出液240 mL/L、蔗糖 3.0 g/L、鉀離子平衡鹽 1.2 mL/L。由此可見25%酵母浸出液和蔗糖分別取了試驗最高值和最低值,即這兩個因素的最佳值可能在試驗水平范圍之外,重新設(shè)計試驗。
根據(jù)試驗1的結(jié)果進行二次優(yōu)化,25%酵母浸出液添加量,重新引入酵母浸出粉。新設(shè)計的試驗包括3個因素,即蛋白胨、酵母浸出粉和蔗糖。再次按照Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理,設(shè)計的三因素三水平的響應(yīng)面分析(RSA)試驗2,共有15個試驗,試驗結(jié)果如表5。
表5 優(yōu)化試驗1響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果
通過SAS的RSREG功能進行數(shù)據(jù)分析,建立二次響應(yīng)面回歸模型,并進而尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平,經(jīng)整理所得的分析結(jié)果如表6。
表6 二次多項回歸模型方程方差分析
三個因素中X1、X2的P值小于0.05,表明X1(蛋白胨)和X2(酵母浸出粉)對反應(yīng)值 Y(A600)的影響顯著;X3的P值為0.287,大于0.05,表明X3(蔗糖)對反應(yīng)值Y(A600)有一定的影響,但不顯著;X1?X3的P值小于0.05,表明X1(蛋白胨)和X3(蔗糖濃度)相互間影響顯著。
使用SAS軟件對上述試驗結(jié)果作RSREG多元回歸分析,得出以Y為因變量,X1、X2、X3為自變量的三元二次回歸方程,對其求極值,得到Y(jié)的最大值為1.94,對應(yīng)各因素的值的位點分別為 X1=0.447,X2=0.863,X3=0.459,轉(zhuǎn)換成培養(yǎng)基成分,即為蛋白胨蛋白胨20.1 g/L、酵母浸出粉13.2 g/L、蔗糖8.3 g/L。結(jié)合試驗設(shè)計所固定的條件和培養(yǎng)基配制的方便性,優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為:胨蛋白胨 20.0 g/L、酵母浸出粉13.0 g/L、25%酵母浸出液100 mL/L、蔗糖 8 g/L、K2HPO4·3H2O 10.0 g,KH2PO43.0 g。
2.3 優(yōu)化后的培養(yǎng)基驗證結(jié)果 按照優(yōu)化的培養(yǎng)基配方配制3瓶100 mL培養(yǎng)基,設(shè)置LB和培養(yǎng)基1作為對照,按0.5%的接種量接種DE-pET-P46重組菌,37℃振搖培養(yǎng)16~18h后收獲,測定其細(xì)胞密度值A(chǔ)600,計算濕菌重。表7結(jié)果顯示,經(jīng)過優(yōu)化后的培養(yǎng)基較LB培養(yǎng)基的菌體濃度高出一倍左右,培養(yǎng)基優(yōu)化試驗基本達到預(yù)期目標(biāo)。
表7 優(yōu)化培養(yǎng)基的驗證試驗結(jié)果
2.4 生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)初步試驗結(jié)果 采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基,使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)DE-pET-P46重組菌菌體,培養(yǎng)24 h后,取樣測定吸光值A(chǔ)600和菌體濕重,結(jié)果分別為2.52和39.5 g/L,菌體濃度是振搖培養(yǎng)的2.7倍。
將生物反應(yīng)器培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)后收獲的DE-pET-P46重組菌菌體與普通振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)的重組菌體分別進行洗滌、裂解后提取包涵體,使用SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖4。圖4結(jié)果表明,使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的重組大腸桿菌DE-pET-P46相比振搖培養(yǎng),在重組蛋白rP46的表達量和包涵體占細(xì)胞總蛋白的比例上均沒有明顯的差異。
圖4 使用生物反應(yīng)器和振搖方法培養(yǎng)的DE-pET-P46重組菌SDS-PAGE電泳圖
高密度發(fā)酵不僅可以減少培養(yǎng)體積,便于下游分離純化,還能縮短生產(chǎn)周期,提高培養(yǎng)基使用效率。通常認(rèn)為大腸桿菌菌體干重達到或超過50 g(DCW)/L即為高密度發(fā)酵。根據(jù)Riesenberg的計算結(jié)果,大腸桿菌發(fā)酵理論上能達到的最高菌體密度為 400 g(DCW/L)[15],考慮到實際培養(yǎng)中受到各種條件限制,Markel等認(rèn)為最高的菌體密度為200 g(DCW/L),此時發(fā)酵液的 25% 充滿了長3 μm、寬1 μm的大腸桿菌,發(fā)酵液粘度很高,幾乎喪失流動性[16]。迄今為止,大腸桿菌發(fā)酵菌體密度最高的兩例報道,一例是非重組E.coli W3110的高細(xì)胞密度發(fā)酵,每升干細(xì)胞重達到174 g[16-17];另一例是生產(chǎn)聚-3-羥基丁酸的重組菌達,每升干細(xì)胞重達175.4 g[18],但近年來沒有干重超過100 g/L的報道。
通過統(tǒng)計學(xué)方法設(shè)計試驗對培養(yǎng)基的成分和添加量進行優(yōu)化,在國內(nèi)外已有很多的報道[15,19-20]。 本研究主要是對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化研究,以期望實現(xiàn)實驗室內(nèi)的重組大腸桿菌DE-pET-P46的高密度發(fā)酵。采用的策略是以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ),對幾種常用營養(yǎng)成分及pH緩沖體系進行試驗,然后確定關(guān)鍵的組份使用SAS統(tǒng)計軟件的響應(yīng)面試驗設(shè)計進行試驗,通過對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,得到最佳的各培養(yǎng)基組份的添加量。
在菌液中細(xì)菌濃度可通過光密度值來體現(xiàn),國內(nèi)外相關(guān)文獻顯示測定所使用的波長有兩種,即560 nm和600 nm,但二者間有何差別與優(yōu)勢,未能找到相關(guān)文獻說明。在本研究開始之前,本實驗室對560 nm和600 nm兩種波長測定重組大腸桿菌DE-pET-P46培養(yǎng)物光密度的差異進行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在所測范圍內(nèi)與濕菌重均具有很好的平行關(guān)系,但后者稍占優(yōu),表明A600更適合于測定本株重組大腸桿菌細(xì)胞密度,以LB不同培養(yǎng)時間的吸光值和菌體重建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,基本為一條直線,R2值達99%。
本研究在對營養(yǎng)成分進行篩選中發(fā)現(xiàn),使用25%酵母浸出液替代酵母粉可獲得更好的菌體密度,蔗糖替代葡萄糖培養(yǎng)效果相當(dāng),引入鉀離子pH緩沖體系對培養(yǎng)基也有一定的改善,但通過對第一輪的響應(yīng)面試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),25%酵母浸出液的最佳添加量在24%以上,超過預(yù)期,可能與其干物質(zhì)太少有關(guān)。在第二輪優(yōu)化過程中,固定25%酵母浸出液的添加量,引入酵母浸出粉,以蛋白胨、酵母粉和蔗糖作為因變量,細(xì)胞密度A600為響應(yīng)量,重新設(shè)計試驗并對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析與計算得到最優(yōu)各因素的優(yōu)化值,轉(zhuǎn)換成培養(yǎng)基成分后得到最佳配方。通過對最優(yōu)配方進行驗證,發(fā)現(xiàn)其菌體濕重相比普通LB培養(yǎng)基有大幅度增加。使用響應(yīng)面試驗設(shè)計進行培養(yǎng)條件和生產(chǎn)工藝優(yōu)化在國內(nèi)已有很多報道,盡管目標(biāo)不盡相同,但所用的方法、統(tǒng)計分析與計算基本相同[21-22]。
使用生物反應(yīng)器進行生物發(fā)酵是現(xiàn)代生物工程的微生物生產(chǎn)工藝的典型方式。相比實驗室的搖菌培養(yǎng),生物反應(yīng)器可以實時控制溫度、pH、溶氧等培養(yǎng)參數(shù),并能根據(jù)需要進行補料控制,使培養(yǎng)物保持在一個優(yōu)良的生長環(huán)境中,從而達到高密度發(fā)酵的目的。本文只是使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中對重組菌DE-pET-P46進行發(fā)酵培養(yǎng),結(jié)果培養(yǎng)產(chǎn)物濕菌重達到近40 g/L,這是振搖培養(yǎng)所難以達到的水平,盡管與菌體干重超過100 g/L的文獻報道差距甚遠。為了確定高密度發(fā)酵條件下,重組菌是否還能像振搖培養(yǎng)一樣大量表達目的蛋白,通過SDS-PAGE進行了對比檢測,結(jié)果表明二者在外源蛋白表達上沒有明顯差別。
高密度發(fā)酵技術(shù)是一個系統(tǒng)性的工程,隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,其優(yōu)越性和巨大的經(jīng)濟潛力將越來越被人們重視。
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