胡海燕，王亦琳，黃耀凌，徐 倩，徐士新，朱馨樂，朱明文

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

鹽酸多西環(huán)素（Doxycycline Hydrochloride）為四環(huán)素類廣譜抗生素，其抗菌活性強(qiáng)于土霉素和四環(huán)素，在獸醫(yī)臨床上有廣泛應(yīng)用。但該藥結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、烯醇基和酰胺基等易氧化水解基團(tuán)，導(dǎo)致了其在水溶液中的不穩(wěn)定性質(zhì)并由此而成為注射液制備的難點(diǎn)。為此，選擇適宜的方法阻止或延緩不穩(wěn)定因素的發(fā)生，尋找一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的最佳條件是注射液制備的關(guān)鍵，而其中pH值是影響注射液穩(wěn)定性的重要因素之一。調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)膒H值可起到延緩藥物水解和氧化的作用。目前，農(nóng)業(yè)部頒布的獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，鹽酸多西環(huán)素注射液的pH值有不同的控制要求［1-2］，這與產(chǎn)品的配方及自身特點(diǎn)有關(guān)。不同配方的產(chǎn)品往往因pH值的不同而呈現(xiàn)穩(wěn)定性的差異。為此，研究探討pH值與穩(wěn)定性之間的關(guān)系，確定最穩(wěn)定pH值及其控制范圍是注射液研制的重要環(huán)節(jié)，但目前以化學(xué)動(dòng)力學(xué)的方法系統(tǒng)地開展穩(wěn)定pH值的研究在獸藥領(lǐng)域未見報(bào)道。本文采用化學(xué)動(dòng)力學(xué)方法對(duì)所研制的鹽酸多西環(huán)素注射液進(jìn)行了穩(wěn)定pH值研究，探討和比較了經(jīng)典恒溫法和單測(cè)點(diǎn)法的應(yīng)用，為預(yù)測(cè)產(chǎn)品穩(wěn)定pH值及其范圍，簡(jiǎn)化試驗(yàn)方法，提高藥物的穩(wěn)定性和安全性提供理論依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 試藥 鹽酸多西環(huán)素（按無(wú)水無(wú)乙醇物計(jì)算，含量97.2%，批號(hào)1001803，石家莊華曙善合藥業(yè)有限公司）；氧化鎂（含量98.1%，江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司）；鹽酸多西環(huán)素對(duì)照品（含量85.2%，批號(hào)K0131001，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；土霉素對(duì)照品（含量92.4%，批號(hào)K0030712，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；美他環(huán)素對(duì)照品（含量88.5%，批號(hào)30499-200802，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；β-多西環(huán)素對(duì)照品（批號(hào)130405-200405，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，配2487紫外檢測(cè)器，Waters公司；LHH-150 SD型藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Memmert UM300烘箱，上海Memmert有限公司；EMS-20恒溫水浴，常州諾基儀器有限公司；PL202-L電子天平，METTLER TOLEDO 公司；IKA RH basic KT／C磁力攪拌器，IKA公司；FE20酸度計(jì)，METTLER TOLEDO公司。

2 方法

2.1 分析方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱phenomenex Luna C18 4.6 mm×250 mm 5 μm；流動(dòng)相：0.05 mol／L 草酸銨溶液-二甲基甲酰胺-0.2 mol／L磷酸氫二銨溶液（65∶30 ∶5）用氨試液調(diào)節(jié) pH 值至 8.0±0.2；柱溫35℃；流速 1.0 mL／L；檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密稱取土霉素（oxy），美他環(huán)素（meta），β-多西環(huán)素（beta-Doxy）和鹽酸多西環(huán)素（Doxy）對(duì)照品適量，按文獻(xiàn)［2］方法和要求進(jìn)行試驗(yàn)及判定。結(jié)果見表1、圖1、圖2。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取鹽酸多西環(huán)素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成濃度為2 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.01 mol／L的鹽酸溶液分別制成濃度為 2.5、5、15、40、80、100、200、400 μg／mL的對(duì)照溶液。按2.1.1項(xiàng)下條件測(cè)定。以對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 供試品的制備 按20%鹽酸多西環(huán)素注射液的處方量稱取鹽酸多西環(huán)素、氧化鎂及其他附加劑，在有機(jī)溶劑和注射用水組成的復(fù)合溶媒中加熱溶解后，降至室溫，用鹽酸或乙醇胺調(diào)節(jié)藥液至pH 2.0～8.0范圍內(nèi)的不同設(shè)定值，過濾，灌裝于5 mL棕色西林瓶中，加蓋密封，制成系列不同pH值的注射液樣品，備用。

2.3 恒溫加速試驗(yàn)

2.3.1 經(jīng)典法 將不同pH值的注射液樣品置于若干恒溫條件下加速分解，間隔一定時(shí)間取樣，測(cè)得不同時(shí)間（t）藥物濃度（C）的變化數(shù)據(jù)，以化學(xué)動(dòng)力學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，考察加熱條件下藥物含量與時(shí)間的關(guān)系，求出各pH樣品的速率常數(shù)（k），以logk對(duì) pH作圖，用圖解法及相關(guān)參數(shù)判定結(jié)果。

2.3.1.1 確定反應(yīng)級(jí)數(shù) 取pH 3.8的鹽酸多西環(huán)素注射液樣品，分別置40、60、80、90℃四個(gè)恒溫條件下，于設(shè)定的不同時(shí)間點(diǎn)間隔取樣，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以藥物相對(duì)百分含量（C%）的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（y），以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)（x）作各溫度下樣品的logC-t圖，考察多西環(huán)素含量與熱時(shí)間關(guān)系，擬合線性回歸方程，以其圖解法進(jìn)行反應(yīng)級(jí)數(shù)的判定。結(jié)果表觀反應(yīng)級(jí)數(shù)基本呈一級(jí)反應(yīng)（表 2、圖3）。

2.3.1.2 預(yù)測(cè)（pH）m 取2.2項(xiàng)配制的7個(gè)不同pH值樣品，置60℃和80℃恒溫條件下考察，于設(shè)定的間隔時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定，以各樣品相對(duì)百分含量的對(duì)數(shù)logC（y）對(duì)時(shí)間t（x）作線性回歸，得兩個(gè)溫度下各pH的直線方程，以公式1：k＝-2.303×斜率計(jì)算速率常數(shù)（k）并與相應(yīng)的pH值作logk-pH圖，進(jìn)行（pH）m預(yù)測(cè)。其k值愈小，說明藥物分解速度愈慢。pH-速度圖（logk-pH圖）最低點(diǎn)（最小值）聯(lián)于橫坐標(biāo)即為最穩(wěn)定 pH值［3］。結(jié)果見表 3～表4、圖4～圖5。

2.3.2 單測(cè)點(diǎn)法 將不同pH值的注射液樣品置若干恒溫條件下加速分解，在一個(gè)設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定藥物含量，與考察前測(cè)定的初濃度（設(shè)定為0時(shí)間點(diǎn)）比較，以公式 2：k＝ 2.303／t×logC0／Ct（k 為速率常數(shù)，C0為初濃度，Ct為時(shí)間t的藥物濃度，t為取樣時(shí)間）計(jì)算各pH樣品的速率常數(shù)，作pH-速度圖，以圖解法及相關(guān)參數(shù)判定結(jié)果。

2.3.2.1 預(yù)測(cè)（pH）m 在2.3.1.2項(xiàng)試驗(yàn)中，7個(gè)不同pH的樣品，在60℃恒溫條件下考察，分別取0、7 d各樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)（表3），根據(jù)2.3.2項(xiàng)公式2計(jì)算k值，作logk-pH圖。結(jié)果見表5和圖6。

2.3.2.2 預(yù)測(cè)（pH）m及其范圍 選取2.2項(xiàng)配制的不同pH值樣品，分組置60℃和80℃條件下考察，于0、10 d取樣測(cè)定含量，以公式2計(jì)算，求出不同pH樣品的k值，以logk對(duì)pH作圖，依據(jù)k值和圖中顯示的最小值區(qū)域，確定（pH）m范圍。結(jié)果見表6、圖7。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 結(jié)果（表1、圖1、圖2）表明：各峰分離度良好，實(shí)際理論塔板數(shù)符合要求。

表1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖1 混標(biāo)（80 μg／mL）溶液色譜圖

圖2 鹽酸多西環(huán)素（Doxy）色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 鹽酸多西環(huán)素線性回歸方程為y＝34468x-11410，相關(guān)系數(shù)為 0.9998 ，在 2.5～400 μg／mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。其色譜條件滿足產(chǎn)品的測(cè)定要求。

3.3 反應(yīng)級(jí)數(shù) 由表2和圖3可知四個(gè)溫度下鹽酸多西環(huán)素的 logC-t為線性關(guān)系，R2值均大于0.95，相關(guān)性良好。其降解基本呈一級(jí)反應(yīng)。

表2 鹽酸多西環(huán)素注射液（pH 3.8）不同溫度下測(cè)定結(jié)果及線性關(guān)系

3.4 穩(wěn)定pH值（經(jīng)典法） 由60℃考察結(jié)果表3看出，pH值為4.0時(shí)，速率常數(shù)k值最小，其次為pH 5.3和pH 3.2，說明在此范圍內(nèi)鹽酸多西環(huán)素注射液降解緩慢。圖4顯示pH 4.0時(shí)出現(xiàn)極小值，即表明，最穩(wěn)定pH值為4.0。此外，在pH 8.0處還出現(xiàn)一個(gè)相對(duì)低點(diǎn)，說明鹽酸多西環(huán)素注射液在此條件下出現(xiàn)減緩降解趨勢(shì)。另外表4和圖5顯示80℃考察的結(jié)果與上基本一致，但相同pH條件下的速率常數(shù)均大于前者，曲線趨于平緩，表明：隨著溫度升高，藥物的降解反應(yīng)增大。

圖3 pH 3.8鹽酸多西環(huán)素含量與熱時(shí)間關(guān)系曲線

表3 60℃條件下不同pH值樣品的線性方程及速率常數(shù)

表4 80℃條件下不同pH值樣品的線性方程及速率常數(shù)

圖4 60℃鹽酸多西環(huán)素注射液pH-速度圖（經(jīng)典法）

圖5 80℃鹽酸多西環(huán)素注射液pH-速度圖（經(jīng)典法）

3.5 穩(wěn)定pH值（單側(cè)點(diǎn)法） 從60℃考察的不同pH條件下的速率常數(shù)（表5）和pH-速度圖（圖6）看出，pH 4.0為最穩(wěn)定pH值，與2.3.1項(xiàng)經(jīng)典法預(yù)測(cè)結(jié)果相同。

表5 單測(cè)點(diǎn)法得到不同pH樣品的速率常數(shù)

圖6 60℃鹽酸多西環(huán)素注射液pH-速度圖（單測(cè)點(diǎn)法）

3.6 （pH）m及穩(wěn)定pH范圍 由表6可以看出，pH在2.0～7.0范圍內(nèi)經(jīng)60℃單測(cè)點(diǎn)考察，在pH 3.8和4.2時(shí)，k值最小，說明穩(wěn)定pH值在3.8至4.2之間，其次是pH 4.5和3.5。在此pH范圍內(nèi)80℃考察結(jié)果顯示pH 4.0時(shí)，k值最小。圖7直觀地顯示了兩個(gè)溫度下的趨勢(shì)線形態(tài)，其最小值在4.0，最小值區(qū)域在3.0～5.0之間。80℃時(shí)的趨勢(shì)線位于60℃趨勢(shì)線上方，說明隨著溫度上升，注射液的不穩(wěn)定性增大。

表6 鹽酸多西環(huán)素注射液不同pH值樣品高溫考察試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論與討論

4.1 降解反應(yīng)規(guī)律考察 為了解藥物降解情況，探討其降解規(guī)律，合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，本文進(jìn)行了四個(gè)不同溫度下多西環(huán)素濃度的對(duì)數(shù)與時(shí)間的線性關(guān)系考察，并對(duì)2.3.1.2項(xiàng)試驗(yàn)中7個(gè)不同pH值樣品在規(guī)定［4］要求的高溫（60℃）條件下進(jìn)行鹽酸多西環(huán)素注射液降解零級(jí)、一級(jí)和二級(jí)反應(yīng)擬合，結(jié)果，在四個(gè)高溫條件和pH 3.2～8.0范圍內(nèi)基本符合一級(jí)反應(yīng)特征。

圖7 鹽酸多西環(huán)素注射液pH-速度趨勢(shì)圖（單測(cè)點(diǎn)法）

4.2 （pH）m及其范圍的確定 為了延緩藥物降解，需要找出最穩(wěn)定pH范圍。通過60℃和80℃兩個(gè)恒溫條件下的加速試驗(yàn)，以經(jīng)典法和單側(cè)點(diǎn)法同時(shí)考察處理，結(jié)合該注射液不同pH值對(duì)氧化性和溶解性的影響試驗(yàn)得出：pH值在3.0～4.0時(shí)鹽酸多西環(huán)素溶解度大，抗氧化能力較強(qiáng)；在中性條件下溶解度小，偏堿條件下易氧化變色的結(jié)果，綜合確定本方法制備的鹽酸多西環(huán)素注射液最穩(wěn)定pH值為4.0，注射液pH值控制在3.0～5.0之間，生產(chǎn)pH值控制在3.8～4.2之間。

該注射液對(duì)熱敏感，生產(chǎn)中要把握關(guān)鍵控制點(diǎn)，嚴(yán)格控制溫度和pH值以保證產(chǎn)品質(zhì)量。

在該pH控制條件下制備的鹽酸多西環(huán)素注射液經(jīng)規(guī)定的［4］穩(wěn)定性考察，各項(xiàng)指標(biāo)符合規(guī)定，穩(wěn)定性良好，有效期兩年。

4.3 簡(jiǎn)化預(yù)測(cè)方法的探討 藥物穩(wěn)定性及（pH）m預(yù)測(cè)的常用方法為恒溫加速試驗(yàn)法，即經(jīng)典法，該方法準(zhǔn)確可靠，但工作量大，時(shí)間長(zhǎng)，數(shù)據(jù)處理繁瑣，試驗(yàn)成本高，為此，出現(xiàn)了一些簡(jiǎn)化方法的研究和探討［5-10］。鑒于酸堿度對(duì)鹽酸多西環(huán)素注射液穩(wěn)定性的重要作用，并為了加快研發(fā)速度，探索簡(jiǎn)化新方法的應(yīng)用，本研究采用經(jīng)典恒溫法和單側(cè)點(diǎn)法進(jìn)行了該注射液（pH）m預(yù)測(cè)，實(shí)驗(yàn)表明，兩種方法所得結(jié)果無(wú)明顯差異。單測(cè)定法簡(jiǎn)單易行，可與穩(wěn)定性試驗(yàn)中的高溫影響因素試驗(yàn)［4］同時(shí)進(jìn)行，極大減少了工作量和研發(fā)成本，明顯提高了新產(chǎn)品研發(fā)的效率。

4.4 存在的問題及注意點(diǎn) 相對(duì)于經(jīng)典恒溫法而言，單側(cè)點(diǎn)法雖然使工作量顯著減少，但由于每個(gè)溫度下只有一個(gè)測(cè)試點(diǎn)，使精確度有所降低，其措施是增加試驗(yàn)溫度數(shù)或在一個(gè)溫度下增加多批次的試驗(yàn)測(cè)試，以提高精確度。

因受條件限制，本試驗(yàn)僅選取60℃和80℃兩個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行恒溫經(jīng)典法和單側(cè)點(diǎn)法預(yù)測(cè)，下一步有待于增加試驗(yàn)溫度數(shù)和批次進(jìn)行復(fù)核試驗(yàn)和相關(guān)探討工作。此外，溶液型制劑（pH）m的控制和調(diào)節(jié)要在考慮穩(wěn)定性的同時(shí)兼顧溶解度、生理療效等因素綜合制定。

［1］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（第九冊(cè)）［S］.

［2］農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心.獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編-獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（第三冊(cè)）［S］.

［3］奚念朱，顧學(xué)裘.藥劑學(xué)（第二版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1980：106-109.

［4］農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心.獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則（藥學(xué)部分）［S］.

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