張金亞，程君生，馮 宇，丁家波，王 楠，皮向成，吳 競(jìng)，張東東，朱良全?，毛開(kāi)榮?

（1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

布魯氏菌是革蘭氏陰性、胞內(nèi)寄生兼性需氧菌，可導(dǎo)致多種動(dòng)物和人患布魯氏菌?。ú疾。斐蓢?yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌目前分為6種陸生、4種海洋布魯氏菌［1-2］。牛種布魯氏菌、羊種布魯氏菌、豬種布魯氏菌是流行廣泛的經(jīng)典布魯氏菌［3-5］。

1932 年Wilson和Miles提出布魯氏菌A、M抗原決定簇的假設(shè)。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)S-LPS含四種抗原決定簇：A、M、C、C／Y，并根據(jù)A 和M 比例，分為 A、M、C（M＞A）、C（M＝A）、C／Y（M＞A）、C／Y（M＝A）、C／Y（A＞M）等 7 類［6-7］。

田間布魯氏菌血清學(xué)檢驗(yàn)時(shí)，菌株間交叉反應(yīng)會(huì)影響布病病原的鑒別診斷。通過(guò)A、M因子血清，可輔助布病病原的種屬鑒別。Pandit等［8］提出了血清與異種抗原交叉吸收的方法，Jones等［9］用活菌2308株和 16M 株、Wilson等［10］用活菌 A544株和16M株制備過(guò)因子血清，但國(guó)內(nèi)未見(jiàn)制備因子血清的文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)選用滅活的16M株和2308株布魯氏菌免疫家兔制備了A、M因子血清，并優(yōu)化了交叉吸收條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及來(lái)源 牛種布魯氏菌2308株（CVCC788）、羊種布魯氏菌 16M 株（CVCC70002）均來(lái)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 大豆酶消化蛋白胨瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）培養(yǎng)基，購(gòu)自BD公司。布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗原參考品（簡(jiǎn)稱“抗原參考品”） ，規(guī)格：5 mL／瓶，批號(hào)：S0100220130312；布魯氏菌病陽(yáng)性血清，規(guī)格：1 mL／瓶，批號(hào)：2001-5；布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)陰性血清，規(guī)格：1 mL／瓶，批號(hào)：2001-5；均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所人畜共患病實(shí)驗(yàn)室提供。16M試管凝集試驗(yàn)抗原、2308試管凝集試驗(yàn)抗原（簡(jiǎn)稱“16M抗原、2308抗原”）按照《獸用生物制品規(guī)程》（2000年版）制備［11］。疫苗佐劑（納米703佐劑）由北京生泰爾生物科技有限公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1.5～2 kg雄性新西蘭大耳白兔，普通級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高免血清的制備

1.2.1.1 種子制備 取2308、16M菌株凍干用菌種各1支，分別啟封后，用1 mL蛋白胨水稀釋，參考OIE方法［12］劃線接種TSA瓊脂平板各2塊，37℃培養(yǎng)72 h，低倍顯微鏡觀察各平板菌落形態(tài)，選取10個(gè)各典型菌落分別劃線接種TSA瓊脂斜面3支，置2～8℃保存不超過(guò)1個(gè)月，備用。

1.2.1.2 細(xì)菌懸液及滅活疫苗的制備 分別將各布魯氏菌菌株密集劃線接種于TSA瓊脂扁瓶，置37℃培養(yǎng)48～72 h，每個(gè)扁瓶用3～5 mL 0.5%的苯酚生理鹽水沖洗培養(yǎng)物制成懸液，經(jīng)4層滅菌紗布過(guò)濾，去除殘留瓊脂。其余菌液80℃水浴2 h滅活［12］。滅活菌液用滅菌生理鹽水洗滌3～4次后，重新懸浮，調(diào)整菌液濃度至 1.2×1011CFU／mL。取適宜體積的該濃度的菌懸液與納米703佐劑按2∶1比例（V∶V）制成滅活佐劑苗。

1.2.1.3 動(dòng)物免疫及血清抗體消長(zhǎng)規(guī)律監(jiān)測(cè) 以6×1010CFU／只頸背部皮下分點(diǎn)注射1.5～2 kg家兔各5只。一免后40 d，以2倍劑量進(jìn)行二免。二免5 d后，耳緣靜脈采血，2 mL／次，常規(guī)方法分離血清并用微量試管凝集試驗(yàn)（MAT）監(jiān)測(cè)抗體效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律。MAT試驗(yàn)參照OIE法［12］進(jìn)行，將待檢血清用0.5%苯酚生理鹽水作1∶10倍稀釋，然后倍比稀釋至1∶5120，在96 U孔凝集板中加入待檢血清50 μL，然后分別加入用0.5%苯酚生理鹽水作1∶20稀釋的抗原參考品、16M抗原和2308抗原，37℃孵育22 h，觀察結(jié)果，并設(shè)立陰、陽(yáng)性血清對(duì)照。

1.2.2 單因子血清的制備

1.2.2.1 血清交叉吸收條件的優(yōu)化 將布魯氏菌菌液用PBS緩沖液洗滌2～3次，8000 r／min離心15 min，棄上清，然后將待吸收血清與吸收用抗原充分混合。制備因子血清的交叉吸收體系見(jiàn)表1。

表1 血清抗原交叉吸收體系

按以下3組單項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行血清交叉吸收條件的優(yōu)化：（1）異種抗原／血清質(zhì)量體積比（W／V）分別為1 ∶5、1 ∶10及 1 ∶20；（2）吸收溫度及時(shí)間分別為4℃吸收2 h、4℃吸收12 h及37℃吸收2 h；（3）吸收過(guò)程中混勻方式分別采取每20 min混勻1次以及130 r／min振蕩孵育。

1.2.2.2 血清交叉吸收后凝集價(jià)的測(cè)定 吸收后的菌液以 8000 r／min離心 15 min，棄菌體。按1.2.1.3項(xiàng)方法通過(guò)MAT檢測(cè)血清對(duì)抗原標(biāo)準(zhǔn)品、16M抗原和2308抗原的抗體反應(yīng)效價(jià)，比較分析并確定最適單因子血清制備參數(shù)。

1.2.2.3 最佳反應(yīng)稀釋濃度的確定 取經(jīng)滅菌生理鹽水適當(dāng)稀釋的因子血清30 μL，加入30 μL凝集試驗(yàn)抗原進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，以1～2 min內(nèi)出現(xiàn)凝集判為陽(yáng)性，判定單因子血清對(duì)16M抗原和2308抗原的反應(yīng)情況，從而確定最佳反應(yīng)稀釋濃度。

1.2.3 血清分裝、凍干及鑒定 將優(yōu)化條件下制取的A、M因子血清，加入適量硫柳汞，使其終濃度為0.01%。按1 mL／瓶分裝、凍干。

1.2.3.1 無(wú)菌檢驗(yàn) 隨機(jī)取凍干血清3瓶，每瓶用1 mL滅菌生理鹽水溶解后，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)［13］。

1.2.3.2 特異性檢驗(yàn) 任取1瓶?jī)龈梢蜃友?，按?.2.2.3的方法進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3.3 效價(jià)測(cè)定 參考OIE方法［12］，采用抗原參考品、16M抗原、2308抗原進(jìn)行MAT試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 家兔抗體效價(jià)變化情況 分別用抗原參考品、2308抗原、16M抗原監(jiān)測(cè)2308株和16M株免疫的家兔的抗體消長(zhǎng)規(guī)律，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢钥闯觯瑢?duì)2308試驗(yàn)組，三者測(cè)得的抗體變化趨勢(shì)基本一致；對(duì)16M試驗(yàn)組，16M抗原與抗原參考品監(jiān)測(cè)得到的抗體效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律一致，且與2308試驗(yàn)組相似，基本表現(xiàn)為一免后20 d抗體效價(jià)處于較高水平，隨后開(kāi)始下降，到二免前（首免第40 d）已經(jīng)明顯下降到較低水平，二免后5 d抗體水平顯著上升，15日抗體水平達(dá)到較高水平，隨后下降。由于2308抗原與16M抗血清的反應(yīng)性不佳，故用2308監(jiān)測(cè)16M抗體產(chǎn)生規(guī)律時(shí)，其結(jié)果偏離以16M或以抗原參照品監(jiān)測(cè)的結(jié)果（圖1）。

圖1 家兔抗體消長(zhǎng)圖

2.2 血清中抗體的交叉吸收

2.2.1 血清吸收條件的優(yōu)化 以用16M抗原吸收兔抗2308血清為例，按表2的吸收條件分別進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。吸收前兔抗2308血清對(duì)抗原參考品、16M抗原、2308抗原的凝集價(jià)分別為1∶1280、1∶320、1∶640。血清交叉吸收后用MAT測(cè)吸收后血清對(duì)抗原參考品、16M抗原、2308抗原的凝集價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 血清吸收條件的方法優(yōu)化及結(jié)果

比較血清交叉吸收后的對(duì)不同抗原的凝集價(jià)，確定當(dāng)抗原與血清質(zhì)量體積比（W／V）為1∶5時(shí)，37℃水浴2 h，期間每隔20 min振蕩混勻1次為最適交叉吸收條件。

2.2.2 血清交叉吸收后凝集價(jià)的測(cè)定 經(jīng)優(yōu)化條件制備得單因子血清后，對(duì)因子血清進(jìn)行特異性的鑒定，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3 因子血清對(duì)參考抗原及同種抗原的凝集價(jià)（MAT）

表4 因子血清對(duì)異種抗原的凝集價(jià)（MAT）

MAT結(jié)果顯示：A因子血清對(duì)抗原參考品和2308抗原的凝集價(jià)均為1∶320（++），對(duì)16M抗原凝集價(jià)為1∶2.5不凝集；M因子血清對(duì)抗原參考品和16M抗原的凝集價(jià)均為1∶160（++），對(duì)2308抗原的凝集價(jià)為1∶2.5為凝集。

2.2.3 因子血清最佳稀釋倍數(shù)的確定 經(jīng)優(yōu)化條件制備得因子血清后，對(duì)因子血清進(jìn)行最佳稀釋倍數(shù)的確定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 因子血清稀釋倍數(shù)的確定

玻片凝集試驗(yàn)顯示，A因子血清對(duì)16M抗原在1∶1時(shí)無(wú)凝集，對(duì)2308抗原在1∶16時(shí)有較明顯凝集顆粒，1∶32稍凝集；M因子血清對(duì)2308抗原在1∶1時(shí)無(wú)凝集，對(duì)16M抗原在1∶16時(shí)有較明顯凝集顆粒，1∶32稍凝集。因子血清對(duì)異種抗原在血清原倍的情況下已無(wú)凝集現(xiàn)象，但仍建議在進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)時(shí)對(duì)血清進(jìn)行1∶2的稀釋。

2.3 單因子血清的鑒定 對(duì)經(jīng)分裝凍干的因子血清進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，證實(shí)無(wú)菌。經(jīng)MAT檢測(cè)因子血清凍干后對(duì)不同抗原凝集價(jià)，結(jié)果顯示：分裝凍干后的A因子血清對(duì)2308抗原的凝集價(jià)為1∶320（++），對(duì)16M 抗原為 1 ∶2.5不凝集；M 因子血清對(duì)16M抗原的凝集價(jià)為1∶160（++），對(duì)2308抗原的凝集價(jià)為1∶2.5不凝集；與凍干前凝集價(jià)比較，發(fā)現(xiàn)凍干對(duì)A因子血清和M因子血清對(duì)抗原的的凝集價(jià)無(wú)影響。經(jīng)玻片凝集試驗(yàn)測(cè)定血清的最佳稀釋比例，結(jié)果顯示：分裝凍干后的A因子血清對(duì)16M抗原在1∶1時(shí)無(wú)凝集，對(duì)2308抗原在1∶16時(shí)有較明顯凝集顆粒，1∶32稍凝集；分裝凍干后的M因子血清對(duì)2308抗原在1∶1時(shí)無(wú)凝集，對(duì)16M抗原在1∶16時(shí)有較明顯凝集顆粒，1∶32稍凝集；與凍干前比較，發(fā)現(xiàn)凍干對(duì)A因子血清和M因子血清的最佳稀釋比例無(wú)影響。

3 討論與小結(jié)

3.1 最適吸收條件的確定 參照文獻(xiàn)報(bào)道的因子血清交叉吸收條件［8-10］并進(jìn)行了優(yōu)化。本試驗(yàn)選用37℃和4℃兩種溫度，2 h和12 h兩種時(shí)間，1∶5、1∶10、1∶20三種抗原血清質(zhì)量比，以及恒溫?fù)u床振蕩及每20 min振蕩混勻兩種孵育模式分別進(jìn)行了試驗(yàn)，對(duì)比吸收后因子血清的抗體效價(jià)及對(duì)同種抗原、異種抗原的反應(yīng)情況，最終確定在抗原與血清質(zhì)量體積比（W／V）為1∶5時(shí)，37℃水浴2 h，期間每隔20 min振蕩混勻1次為最適宜的吸收條件。

3.2 最適采血時(shí)間的確定 文獻(xiàn)報(bào)道活菌一免后6 d，不經(jīng)二免，最適宜采血并進(jìn)行交叉吸收［9］。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如免疫后較短時(shí)間內(nèi)采血，此時(shí)血清對(duì)異種抗原的凝集價(jià)相對(duì)較低，但血清的抗體效價(jià)并不很高，經(jīng)異種抗原交叉吸收后對(duì)同種抗原的凝集價(jià)也較低（1∶80左右）［10］；而二免后抗體效價(jià)上升，盡管血清對(duì)異種抗原凝集價(jià)升高，但血清經(jīng)交叉吸收后對(duì)同種抗原的凝集價(jià)較高（1∶160和1∶320），故建議先獲得高免血清（≥1∶2560），再進(jìn)行血清的交叉吸收。

3.3 本試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn) 以往制備因子血清大都采用活菌免疫［8-10］，而本試驗(yàn)選用滅活的 16M株和2308株免疫家兔，操作安全。對(duì)比文獻(xiàn)制備的因子血清與試驗(yàn)制備的因子血清發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)制備的因子血清特異性更強(qiáng)，抗體效價(jià)高。

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