孫林杰，王雪平，宋國亮，2，陳凌燕，焦金波，白朝勇，2*

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽471000;2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽471000)

鴨肝炎(DH)是一種傳播迅速并高度致死雛鴨的疫病，以肝炎為主要特征［1］，主要侵害4周齡內(nèi)雛鴨，特別是不足1周齡的雛鴨最易感染，死亡率高達(dá) 90% 以上［2］。1992 年，Sandhu［3］曾報道有Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒(DHV－1)的變異株，命名為DHV －1a。近年來，蘇敬良［4］、范書才［5］、張大丙［6］、何冉婭［7－8］、林世堂［9］、M.C.Kim［10－11］、Tseng［12－13］等人相繼報道了與 DHV －1 不同的新型DHV。新型鴨肝炎病毒的不斷出現(xiàn)制約著養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

2010 年，作者從山東某養(yǎng)鴨場病料中分離出一株疑似鴨肝炎病毒，并對其特性進(jìn)行了深入研究，以期為指導(dǎo)本地鴨病毒性肝炎的防治工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DHV－1型肝組織毒LY株、DHV－1型鴨胚適應(yīng)毒LY－20株、DHV－1型LY株蛋黃抗體:普萊柯生物工程股份有限公司提供;標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型DHV陽性血清:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所范書才老師惠贈;非免疫鴨蛋及雛鴨:均購自洛陽富民養(yǎng)禽有限公司。

1.2 病毒分離及傳代

1.2.1 樣品采集及處理 無菌采集病變典型的送檢鴨肝臟，加入4倍體積的滅菌PBS，研細(xì)，凍融3次，加 5%的氯仿，振搖 20 min，離心取上清，0.22 μm濾膜過濾，參照《中華人民共和國獸藥典》［14］經(jīng)無菌、支原體及相關(guān)病原檢測合格后分裝，作為接種用樣品，－70℃凍存。

1.2.2 鴨胚病毒分離及傳代 將上述樣品做100倍稀釋后經(jīng)尿囊腔接種10日齡易感鴨胚，0.1 mL/胚，置37℃觀察168 h，收獲48～120 h死亡的鴨胚液及肝臟，將收獲的鴨胚液及肝臟研細(xì)，離心取上清，經(jīng)無菌及支原體等檢驗(yàn)合格后分裝，作為鴨胚適應(yīng)毒，－70℃凍存。

1.2.3 雛鴨病毒分離及傳代 將上述樣品做100倍稀釋后，經(jīng)腿部肌肉接種4日齡易感雛鴨，0.1 mL/只。觀察168 h，無菌采集攻毒后20～72 h死亡且病變典型的雛鴨肝臟，按上述病料處理方法處理后置－70℃凍存。

1.3 病毒鑒定

1.3.1 病毒含量及毒力測定

1.3.1.1 用鴨胚測定 將鴨胚適應(yīng)毒經(jīng)10倍系列稀釋，取適宜稀釋度經(jīng)尿囊腔接種10日齡易感鴨胚，每個稀釋度接種5枚，0.1 mL/枚，37℃觀察168 h，根據(jù) 24 h～168 h的死胚，按照 Reed－Muench法計算鴨胚半數(shù)致死劑量(ELD50)。

1.3.1.2 用雛鴨測定 將雛鴨肝組織毒經(jīng)10倍系列稀釋，取適宜稀釋度經(jīng)腿部肌肉注射4日齡易感雛鴨，每個稀釋度接種5只，0.1 mL/只，觀察10 d，根據(jù)雛鴨死亡情況，計算雛鴨半數(shù)致死劑量(LD50)。

1.3.2 本動物回歸試驗(yàn) 選擇4日齡易感雛鴨，將鴨胚適應(yīng)毒 E2代(105.32ELD50/0.1 mL)經(jīng) 100 倍稀釋后，腿部肌肉注射試驗(yàn)組雛鴨，空白對照組注射 PBS，0.1 mL/只，隔離飼養(yǎng)觀察 168 h，記錄死亡及剖檢情況。

1.3.3 理化特性鑒定 參照文獻(xiàn)方法［15］進(jìn)行部分理化特性研究。用鴨胚適應(yīng)毒E8代病毒液進(jìn)行紅細(xì)胞(豬、雞、鴨、兔、羊、小鼠)凝集試驗(yàn)、脂溶劑(乙醚和氯仿)敏感性、胰酶敏感性、耐酸性和耐熱性試驗(yàn)。

1.3.4 中和試驗(yàn)

1.3.4.1 特異性血清中和試驗(yàn) 將鴨胚適應(yīng)毒E8代和LY－20株E32代病毒液稀釋至病毒含量為200 ELD50/0.1 mL，分別與等量標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型DHV陽性血清混合，37℃中和1 h，0.2 mL/枚，同時設(shè)病毒和空白對照，5枚/組，37℃培養(yǎng)168 h，記錄各組死亡情況。

1.3.4.2 交叉中和試驗(yàn) 采用固定病毒稀釋血清法［14］進(jìn)行。將鴨胚適應(yīng)毒E8代和LY－20株E32代病毒液稀釋至病毒含量為200 ELD50/0.1 mL，取適宜稀釋度抗體與等量稀釋后病毒液混合，37℃中和1 h，0.2 mL/枚，分別設(shè)病毒和空白對照，5 枚/組，37℃培養(yǎng)168 h，記錄各組死亡情況，以50%鴨(雞)胚保護(hù)的最高抗體稀釋度為抗體的中和效價。

1.3.5 雛鴨交叉保護(hù)試驗(yàn) 將4日齡雛鴨分為7組，10只/組，將分離株和LY－20株抗體稀釋成含512個中和效價單位，按表1注射抗體，24 h后攻毒，同時設(shè)病毒和空白對照，隔離飼養(yǎng)觀察168 h。記錄各組死亡數(shù)，計算保護(hù)率。

表1 雛鴨交叉保護(hù)試驗(yàn)-抗體注射及攻毒詳情

1.3.6 對不同日齡雛鴨的毒力測定 將分離株E2代肝組織毒稀釋至病毒含量為100 LD50/0.1 mL，分別接種4日齡、8日齡、12日齡、16日齡、20日齡雛鴨，每個日齡段接種10只雛鴨，0.1 mL/只，隔離飼養(yǎng)觀察168 h，記錄各組死亡情況。

1.3.7 RT－PCR檢測 根據(jù) GenBank中已公布的韓國N－DHV全基因組序列，設(shè)計引物，韓國新型VP1引物序列為:上游引物5＇－CAGATGGCCGCCAATGATCAG－3＇，下游引物 5＇－ GTCTCTGACATTTCGAAATTGGTATGA －3＇，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。參照文獻(xiàn)方法［16］，將采集的病料、鴨胚適應(yīng)毒、雛鴨傳代肝組織毒等進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，參照GenBank公布的預(yù)計擴(kuò)增片段大小為768 bp。

1.3.8 PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增與測序分析 將PCR產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)公司測序，應(yīng)用 DNA Star5.07基因分析軟件包對VP1基因測序結(jié)果進(jìn)行分析整理，確定序列正確。將測序結(jié)果提交NCBI BLAST SERVER(Version2.0)與鴨肝炎病毒VP1基因序列進(jìn)行在線比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 鴨胚傳代及病毒含量測定 結(jié)果見表2。在鴨胚上連續(xù)傳至E8代，鴨胚傳代死亡時間主要集中在90～120 h，剖檢病變:胎兒全身水腫，肝臟腫大并有出血點(diǎn)，傳至E6代后鴨胚死亡規(guī)律且毒價較穩(wěn)定，表明該分離株能很好的適應(yīng)10日齡鴨胚。

表2 鴨胚傳代及病毒測定結(jié)果

2.2 雛鴨傳代及病毒含量測定 該分離株用4日齡雛鴨進(jìn)行傳代，各代次的雛鴨死亡情況及毒價測定見表3。雛鴨于攻毒后20 h開始死亡，死亡高峰集中在20～72 h，死亡雛鴨呈典型的角弓反張狀態(tài)，剖檢病變:肝臟腫大，并伴隨有點(diǎn)狀或塊狀出血。

表3 雛鴨傳代及病毒含量測定結(jié)果

2.3 本動物回歸試驗(yàn) 試驗(yàn)組10只雛鴨72 h內(nèi)全部死亡，死亡狀態(tài)角弓反張(圖1)，剖檢變化:肝臟腫大，并伴隨有大量出血斑點(diǎn)(圖2)。對照組10只雛鴨全部健活，剖檢后雛鴨無任何病變。

2.4 理化特性鑒定 結(jié)果見表4。分離株經(jīng)脂溶劑(氯仿和乙醚)、酸、熱、胰酶處理后，毒價差異不到2個滴度，表明為無囊膜病毒，且對以上處理均不敏感。凝集試驗(yàn)顯示該分離株不凝集任何紅細(xì)胞，即無血凝性。

圖1 角弓反張

圖2 肝臟腫大、出血

表4 理化特性鑒定結(jié)果

2.5 特異性血清中和試驗(yàn) 結(jié)果見表5。死亡胚肝臟腫大，并伴有出血點(diǎn)等典型癥狀。結(jié)果表明分離株不能被標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型DHV陽性血清中和，LY－20株能被標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型DHV陽性血清中和，說明二者為不同血清型。

表5 特異性血清中和試驗(yàn)結(jié)果

表6 交叉中和試驗(yàn)抗體效價測定結(jié)果

表7 口蹄疫病毒亞型區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)

2.7 雛鴨交叉保護(hù)試驗(yàn) 結(jié)果見表8，且死亡雛鴨經(jīng)剖檢呈典型鴨肝炎癥狀?？梢钥闯觯瑑蓚€毒株之間無交叉保護(hù)作用，即分離株與DHV－1為不同血清型。

表8 雛鴨交叉保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

2.8 對不同日齡雛鴨的毒力測定 結(jié)果見表9，可見對12日齡內(nèi)雛鴨致死率達(dá)100%。病死雛鴨經(jīng)剖檢有肝臟腫大，并伴有出血點(diǎn)。12日齡后隨著日齡的增大，雛鴨的死亡率逐漸降低。

表9 對不同日齡雛鴨的毒力測定試驗(yàn)結(jié)果

2.9 RT－PCR檢測 用韓國N－DHV引物對分離株進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見與試驗(yàn)設(shè)計相符的768 bp電泳條帶(圖3)，而DHV－1 LY－20株擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

2.10 PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增與測序分析 將測序結(jié)果與鴨肝炎病毒VP1基因序列進(jìn)行比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果顯示該分離株與韓國N－DHV VP1基因序列同源性在99%以上，該分離株與韓國N－DHV屬同一基因型，且與臺灣N－DHV相鄰，但與DHV－1處于明顯不同的分支。

圖3 RT-PCR結(jié)果

圖4 分離株(DHV-SD-2010)測序結(jié)果核苷酸進(jìn)化分析

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)使用10日齡易感鴨胚對分離株進(jìn)行了傳代培養(yǎng)，該分離株經(jīng)本動物回歸試驗(yàn)、理化特性試驗(yàn)、交叉中和試驗(yàn)、雛鴨交叉保護(hù)試驗(yàn)、對不同日齡雛鴨的毒力測定試驗(yàn)及RT－PCR檢測等試驗(yàn)鑒定為新型鴨病毒性肝炎病毒，并命名為SD株。本試驗(yàn)成功分離到一株與DHV－1無血清學(xué)交叉免疫反應(yīng)的新型DHV，并建立毒株之間的相關(guān)性，為我公司開展研制鴨肝二價精制蛋黃抗體及診斷試劑的研究工作奠定基礎(chǔ)。

由于新型鴨病毒肝炎病毒的流行，僅用Ⅰ型鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體對雛鴨進(jìn)行免疫達(dá)不到理想效果，給鴨肝炎病毒的防治帶來困難。及時用鴨肝二價精制蛋黃抗體可作為預(yù)防鴨病毒性肝炎病毒流行的一種有效辦法，但新型DHV抗體的中和效價與雛鴨保護(hù)率之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。同時，長期不斷地收集DHV流行毒株，及時關(guān)注鴨肝炎病毒的流行傳播特點(diǎn)，可為該病的科學(xué)防控提供試驗(yàn)依據(jù)。

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