羅成江，林仙軍，周志強，周芷錦，應永飛

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州310020)

復方多聚甲醛粉由多聚甲醛、苯甲酸與水楊酸按照3∶1∶1的比例配制而成，用于蠶室、蠶具消毒。農(nóng)業(yè)部公告第1435號關于復方多聚甲醛粉中水楊酸和苯甲酸的檢測方法采用紫外分光光度法和容量法［1］，此方法操作過程繁瑣，計算較為復雜。因此，研究并建立一種高效、準確的高效液相色譜法測定復方多聚甲醛粉中水楊酸和苯甲酸的含量具有重要意義。目前關于高效液相色譜法同時測定其他制劑中水楊酸和苯甲酸的含量已有報道［2－4］。本文按照《獸藥質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則》在對色譜條件、專屬性、線性關系、穩(wěn)定性、重復性等方面進行考察后［5］，建立了高效液相色譜法同時測定復方多聚甲醛粉中水楊酸和苯甲酸含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1260系列高效液相色譜儀，配紫外檢測器;AG－285電子天平(Mettler公司);KQ－500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TU－1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 試藥與試劑 水楊酸對照品來源為中國食品藥品檢定研究院，批號為100106－201104，含量為99.9%;苯甲酸對照品來源為中國藥品生物制品檢定所，批號為100419－200301，含量為100.0%;水為超純水;甲醇為色譜純;乙醇及其他試劑均為分析純。

1.3 高效液相色譜條件 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，以 0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(取6.8 g磷酸二氫鉀，加水900 mL溶解后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，加水定容至1000 mL)－甲醇(90∶10)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長230 nm，柱溫40℃，進樣量10 μL。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品儲備液的制備 取水楊酸對照品和苯甲酸對照品各約20 mg，精密稱定，置同一100 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并稀釋至刻度，制成每毫升含水楊酸和苯甲酸約為200 μg的溶液，作為對照品儲備液。

1.4.2 對照品溶液的制備 精密量取適量對照品儲備液，用流動相稀釋制成水楊酸和苯甲酸濃度均為20.0 μg/mL的對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取復方多聚甲醛粉樣品0.2 g(約相當于水楊酸和苯甲酸各40 mg)，置200 mL量瓶中，加50%乙醇80 mL，超聲提取10 min，放至室溫后用50%乙醇溶液稀釋至刻度，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 按上述色譜條件，分別對對照品溶液、樣品溶液和空白溶液進行分析比對(結(jié)果見圖1、圖2、圖3)，以確定是否對水楊酸和苯甲酸峰有影響。結(jié)果表明:空白溶液中無水楊酸和苯甲酸吸收峰，對照品溶液和樣品溶液中水楊酸峰和苯甲酸峰分離度最小為4.9，符合要求。

圖1 水楊酸和苯甲酸對照品溶液的高效液相色譜圖

圖2 供試品溶液的高效液相色譜圖

圖3 空白(多聚甲醛)溶液的高效液相色譜圖

2.2 回收率試驗 取配制復方多聚甲醛粉用多聚甲醛為空白樣品，稱取適量的水楊酸和苯甲酸對照品添加到已準確稱量的空白樣品中，混合均勻，作為添加樣品，進行加樣回收率試驗，以考察方法的準確度?；厥章式Y(jié)果見表1和表2，從回收率結(jié)果可以看出水楊酸平均回收率為99.06% ～99.69%，RSD為0.09% ～0.63%;苯甲酸平均回收率為99.12% ～99.73%，RSD 為0.16% ～0.48%。

表1 復方多聚甲醛粉中水楊酸的添加回收率 (n=3)

表2 復方多聚甲醛粉中苯甲酸的添加回收率 (n=3)

2.3 線性關系考察 分別精密量取適量的標準儲備液，用流動相稀釋成水楊酸和苯甲酸濃度均為1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/mL 的標準系列工作液，按上述色譜條件分析，分別以峰面積對進樣濃度進行回歸，求得回歸方程。水楊酸回歸方程為Y＝ 1.1 × 105X+12559，在1.0 ～50 μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)為0.9999;苯甲酸線性回歸方程為 Y ＝ 1.0 ×105X+13627，在1.0～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)為0.9999。

2.4 精密度試驗 取水楊酸和苯甲酸混合對照品溶液(20 μg/mL)，按上述色譜條件重復連續(xù)進樣6次，測定峰面積，水楊酸和苯甲酸峰面積的RSD分別為0.55%和0.20%，表明此方法的儀器精密度符合要求。

2.5 穩(wěn)定性試驗 對供試品溶液分別于0、2、4、6、12、24 h進樣，記錄峰面積，計算RSD分別為0.75%和0.17%，表明該方法24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復性實驗 取適量水楊酸和苯甲酸對照品分別配制成相當于水楊酸和苯甲酸測試濃度的80%、100%、120%的供試品溶液，每種濃度做3個平行，水楊酸和苯甲酸 RSD分別為 0.56%、0.43%、0.64% 和 0.65%、0.62%、0.82%，表明該方法重復性良好。

2.7 樣品測定 取3批復方多聚甲醛粉樣品(產(chǎn)地:湖州天健獸藥有限公司;批號:20130318、20130319、20130320)制成供試品溶液，每個批次做5個平行，進樣分析，記錄峰面積，按外標法計算水楊酸與苯甲酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中水楊酸與苯甲酸的含量測定

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測波長的選擇 為了確定最佳檢測波長，采用紫外分光光度法對最佳檢測波長進行了考察。用50%乙醇溶液溶解水楊酸和苯甲酸，并稀釋至7 μg/mL，參照紫外可見分光光度法，在200～400 nm的波長范圍進行掃描，水楊酸在230 nm和302 nm的波長處有最大吸收，苯甲酸在227 nm和272 nm波長處有最大吸收。因此，本實驗綜合考慮選擇230 nm作為檢測波長。

3.2 提取溶劑的選擇 水楊酸和苯甲酸均易溶于乙醇，因此選用50%乙醇作為前處理提取溶劑，直接用50%乙醇定容上機，峰形不佳，故第二步改用流動相定容上機。

3.3 液相色譜分離條件的確定 本研究對Waters Symmetry C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)柱、Waters Atlantis C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱、Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)柱等三種規(guī)格的色譜柱進行了比較，結(jié)果表明分離結(jié)果均較為滿意。在流動相選擇上，比較了磷酸鹽緩沖液/甲醇、磷酸溶液/甲醇和水/甲醇體系的色譜保留性能和靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸鹽緩沖液/甲醇流動相體系水楊酸和苯甲酸峰型最好、靈敏度最高。進一步優(yōu)化磷酸鹽緩沖液濃度和流動相配比，使水楊酸和苯甲酸獲得最佳峰型和保留時間，最終確定流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 6.0)－甲醇(90∶10，V∶V)，流速為1.0 mL/min。

獸藥國家標準匯編(第一冊)關于復方多聚甲醛粉中水楊酸和苯甲酸含量的檢測方法采用的是紫外－可見分光光度法和滴定法，本文在對色譜條件、線性關系、穩(wěn)定性、重復性等方面進行考察后，建立了高效液相色譜法。實驗結(jié)果表明，該方法操作簡便、結(jié)果準確、穩(wěn)定性好，能有效檢測復方多聚甲醛粉中水楊酸和苯甲酸含量。

［1］農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心.農(nóng)業(yè)部公告第1435號.獸藥國家標準匯編(第一冊)［S］.

［2］余小平，舒金富，黃 華，等.HPLC法同時測定華佗膏中水楊酸苯甲酸的含量［J］.中國藥品標準，2010，5(11):375 －377.

［3］張 京，閆 薈，費 嘉，等.HPLC法測定復方選凈散中水楊酸和苯甲酸的含量［J］.藥品檢驗，2012，7(19):115 －146.

［4］黃 潔，李峰武，劉鵬鳴，等.反相高效液相色譜法測定復方水楊酸酊中水楊酸和苯甲酸含量［J］.中國藥業(yè)，2012，21(20):39－40.

［5］中國獸藥典委員會.中國獸藥典二○一○年版一部［S］.