周 煒，陳慧華，應永飛，陸春波，林仙軍，朱聰英

(浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，杭州310020)

2013年3月，本實驗室收到某品牌獸藥樣品若干，經(jīng)調(diào)查這些獸藥明顯具有標簽外藥物的生理/藥理學作用，即可明顯促進育肥豬采食、提高出肉率，但具體是其中哪種藥及具體成分不明。為配合相關行政執(zhí)法部門嚴厲打擊畜產(chǎn)品質(zhì)量安全犯罪、超范圍濫用獸藥等違法行為，保障畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，急需對其中非法添加的未知成分進行篩查與確證。

目前，國際上多用核磁法和飛行時間質(zhì)譜法等技術對某種未知成分進行定性分析［1-2］。但這些技術對儀器的要求，限制了其應用與推廣。自20世紀50年代開始，基于常規(guī)四級桿質(zhì)譜發(fā)展而來的四級桿/線性離子阱質(zhì)譜技術日趨成熟［3-4］，已廣泛應用于檢驗檢測領域。針對離子阱可進行選擇性離子富集與裂解功能而研發(fā)的增強子離子掃描(Enhanced Product Ion Scan，EPI)技術，可根據(jù)可疑目標化合物的質(zhì)荷比、裂解規(guī)律等參數(shù)，自動與已建譜庫中的化合物進行匹配分析，從而實現(xiàn)對復雜基質(zhì)中目標化合物的確證與測定［5-6］。然而，迄今為止，利用四極桿/線性離子阱質(zhì)譜對未知物進行篩查的方法鮮有報道。本研究旨在以如何確證上述獸藥中非法添加氯丙那林的過程為例，初步探討了四級桿/線性離子阱質(zhì)譜在獸藥非法添加物篩查中的運用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 1290N高效液相色譜儀(美國Agilent公司);AB 5500 Q-Trap質(zhì)譜儀(美國AB公司)，配電噴霧離子源(ESI);電子天平(瑞士Mettler，精度十萬分之一);離心機(德國Sigma公司)。

1.1.2 試劑與藥品 試驗用甲醇、乙腈、醋酸鉛均為分析純，甲酸及作為流動相的甲醇均為色譜純，水為超純水。氯丙那林(Clorprenaline，CLN)標準品購自Witega公司。所檢陽性樣品(包含:水性溶劑注射液、非水性溶劑注射液和中獸藥散劑等三種劑型)及相應陰性對照樣品均來自公安和農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法部門。

1.1.3 EPI譜庫 本實驗室已對激素類、鎮(zhèn)定劑/抑郁藥類、脫羧酶抑制劑類、中樞神經(jīng)興奮劑類、抗病毒類等五大類藥物進行了EPI譜庫建立，譜庫中“瘦肉精”類藥物包括:馬噴特羅、溴代克倫特羅、克倫塞羅、克倫異磅特羅、克倫潘特、羥甲基克倫特羅、Clenhexerol、馬布特羅、妥布特羅、溴布特羅、氯丙那林、噴布特羅、西布特羅、特布他林、非諾特羅、克倫普羅、西馬特羅、萊克多巴胺、齊帕特羅、班布特羅、沙丁胺醇、丙卡特羅、克倫特羅、福莫特羅(阿福特羅)、苯乙醇胺A等25種藥物。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 結合目標化合物的生物學功用，推測其極有可能屬于“瘦肉精”類化合物。由于“瘦肉精”類化合物多易溶于水，故本試驗均采用水溶性目標化合物處理方法。

水性溶劑注射液:量取供試品適量，用0.2%甲酸水稀釋依次成100倍、104倍和106倍稀釋液，按濃度從低到高過膜上機，直至檢測濃度適宜為止。

非水性溶劑注射液與中獸藥散劑:取相應供試品適量(非水性溶劑注射液:5.0 mL;中獸藥散劑:5.0 g)于50 mL離心管中，加入20 mL 0.2%甲酸水，水浴超聲提取30 min，期間每5 min振搖1次。12000 r/min離心10 min，取上清液適量，用0.2%甲酸水稀釋依次成100倍、104倍和106倍稀釋液，按濃度從低到高過膜上機，直至檢測濃度適宜為止。

1.2.2 靶目標分子篩查方法 為得到目標化合物的分子質(zhì)量數(shù)信息，本研究采用Q3全掃描方式，通過比較樣品與陰性對照的差異，獲取靶目標化合物的分子質(zhì)量。

質(zhì)譜條件:采集模式為蠕動泵進樣，ESI+模式Q3全掃描;泵流速為5 μL/min;離子源電壓5500 V;輔助加熱氣溫度550℃;氣簾氣流速40 L/h;離子源氣流流速霧化氣(Gas1)15 L/h、輔助氣(Gas2)20 L/h;DP(Declustering Potential，去簇電壓)50 eV;碰撞室入口電壓(Entrance Potential，EP)10 eV;碰撞室出口電壓(Collision Cell Exit Potential，CXP)10 eV;掃描速率200 Da/s。

1.2.3 靶目標分子質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化 為得到質(zhì)荷比為214.2 Da的靶目標分子準確質(zhì)量數(shù)及MRM(Multiple Reaction Monitoring)模式下的質(zhì)譜參數(shù)，本試驗先用0.2%甲酸水/甲醇/乙腈(50∶25∶25，V/V)對Q3全掃描上機液進行了10倍稀釋，并依次優(yōu)化了DP、EP、母離子質(zhì)荷比、兩特征子離子的碰撞能量(Collision Energy，CE)、CXP與子離子質(zhì)荷比等參數(shù)。

1.2.4 靶目標分子的色譜分離 在篩查得到靶目標分子母離子質(zhì)荷比后，初步驗證了其屬于“瘦肉精”類物質(zhì)的推測，適用未知物篩查ESI+模式下的通用色譜條件進行分離。色譜條件:色譜柱:Waters Atlantis dC18 柱(3.0 mm ×150 mm，粒徑3 μm);流動相及流速見表1;柱溫:30℃;進樣量:5 μL。

表1 通用流動相和流速

根據(jù)靶目標分子的保留時間與洗脫特性，對流動相組成進行了適當優(yōu)化，以得到最佳色譜條件。優(yōu)化后的流動相見表2。

表2 流動相組成和流速

1.2.5 靶目標分子的定性確證方法 在優(yōu)化了色譜條件后，本試驗用儀器自帶的“MRM-IDA(Information Dependent Acquistion)-EPI”(多反應監(jiān)測觸發(fā)增強子離子掃描)技術進行了譜庫匹配檢索，以進一步作定性確證。

質(zhì)譜條件:MRM條件電噴霧離子源;正離子掃描;多反應監(jiān)測;離子源電壓:5500 V;碰撞氣能量:高;輔助加熱氣溫度:550℃;氣簾氣流速:40 L/h;離子源氣流流速:Gas1為50 L/h，Gas2為35 L/h。目標化合物MRM參數(shù)見表3。

表3 多反應監(jiān)測條件

IDA條件［5-6］:進行IDA監(jiān)測時允許質(zhì)量數(shù)偏離范圍為±250 mDa;啟用動態(tài)背景扣除(MRM響應值超出5000 cps，選擇1個最強離子觸發(fā)IDAEPI);當MRM到達已建庫化合物的保留時間且響應值超出6000 cps，強制1個最強離子觸發(fā)IDA-EPI。

EPI條件:掃描速率10000 Da/s;進行 EPI時CE為35、(35±15)eV(即最終所獲得的EPI譜圖為20、35、50 eV三個水平的碰撞能量下的疊加圖)。

2 結果與分析

2.1 靶目標分子量篩查 本試驗通過陰性對照的方法，尋找樣品譜圖中除陰性對照樣品峰外的特征離子峰，對靶目標母離子質(zhì)荷比進行篩查。由于四極桿質(zhì)譜中Q1部分，對質(zhì)量數(shù)的定量不能滿足試驗要求，因而采用Q2不進行碰撞裂解的Q3全掃描。掃描結果如圖1、圖2所示，所檢“扶正解毒散”樣品色譜圖中在214.2 Da處有明顯特征離子峰，與氯丙那林母離子質(zhì)荷比(213.7 Da)相近。

圖1 陰性對照樣品Q3掃描圖

圖2 樣品Q3掃描圖

2.2 靶目標分子的色譜分離 為保障高通量定性分析的可比性，本實驗室對雌激素類、同化激素、鎮(zhèn)定劑/抑郁藥類、受體激動劑類、抗病毒類等均用ESI+離子源模式進行電離的藥物，建立了通用流動相條件，以便于直接進行MRM-IDA-EPI譜庫檢索。在初步得到驗證結果后，再對流動相條件進行進一步優(yōu)化，然后在該流動相條件下對靶目標分子與標準物的譜圖進行匹配度查詢。通用模式下靶目標化合物的離子流圖見圖3，優(yōu)化流動相及稀釋倍數(shù)后的靶目標化合物的離子流圖見圖4。如圖4所示，經(jīng)優(yōu)化條件后，靶目標化合物與基質(zhì)得到了良好分離。

2.3 靶目標分子的定性確證 如圖5、圖6所示，在優(yōu)化色譜條件后，靶目標化合物的保留時間(6.92 min)與氯丙那林對照品的保留時間(6.93 min)一致，均有質(zhì)荷比為 154.1 Da、119.0 Da、91.0 Da 和76.9 Da特征碎片離子，且這四個特征碎片離子的峰度比也高度一致。從圖7中可以看出，EPI譜庫檢索匹配度為93.2，遠大于80的判定標準［7-8］。根據(jù)歐盟2002/657/EC決議要求，共獲得7個識別點［7］，遠高于歐盟96/23/EC指令附錄I的A組的物質(zhì)(β-興奮劑)確認要求(4個識別點)［9］?；谌缟辖Y果，該靶目標化合物可定性為氯丙那林。

圖3 通用模式下的總離子流圖

圖4 優(yōu)化參數(shù)后的總離子流及CLN提取離子流圖

圖5 靶目標化合物的MRM譜圖(圖A)和EPI譜圖(圖B)

圖6 氯丙那林標準品的MRM譜圖(圖A)與EPI譜圖(圖B)

圖7 靶目標化合物與氯丙那林標準品的EPI譜圖匹配度結果圖

3 討論

本研究以定性確證某品牌獸藥中非法添加有氯丙那林的過程為例，建立了一整套利用高效液相色譜串聯(lián)四級桿/線性離子阱質(zhì)譜對獸藥中非法添加物進行定性確證的方法，即:先從基質(zhì)中提取目標化合物，利用Q3全掃描得到其分子質(zhì)量數(shù)，隨后對其HPLC、MRM參數(shù)進行優(yōu)化，最后利用EPI譜庫檢索進行定性確證。

利用四級桿/線性離子阱進行未知物篩查與驗證，過程可分為Target Scan和Non-target Scan兩種方式進行。Target Scan是基于已知目標化合物可能的生理/藥理學作用一類篩查方法，主要通過數(shù)據(jù)庫比對、類似物分析兩種方法進行。Non-target Scan是針對完全未知物的一類篩查方法［3］，目前主要通過特征離子的質(zhì)量與結構，結合這些結構潛在的生理、藥理學作用、經(jīng)濟價值等情況進行。

本研究建立了一整套從獸藥中篩查并確證非法添加物的Target Scan方法。對于已建立譜庫的非法添加物或超標簽范圍使用的化學成分，可利用此方法對獸藥、飼料及畜產(chǎn)品開展針對性篩查。同時，這一方法對于這些藥物的同系物或類似物的篩查也具有一定指導性意義。就Non-target Scan方法而言，還需要在樣品前處理過程中引入有機溶劑提取處理，在Q3全掃描和MRM方法建立時引入ESI-模式等處理方法以拓寬篩查范圍。此外，無論是Target Scan，還是Non-target Scan，尋找合適的陰性對照物、探明靶目標化合物可能的生理/藥理學作用對于畜產(chǎn)品及相關投入品中未知物的篩查均有著至關重要的意義。

由于四級桿/線性離子阱質(zhì)譜仍屬低分辯質(zhì)譜，無法獲得飛行時間質(zhì)譜等高分辯質(zhì)譜分析時所能得到的離子精確質(zhì)量數(shù)和高通量同時掃描［1］，因而目前還只能依賴標準物質(zhì)及譜庫的建立，而譜庫的建立又需要長期的積累與維護。

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［5］張鴻偉，蔡 雪，林黎明，等.液相色譜-四極桿/離子阱質(zhì)譜同時確證和測定肌肉中16種同化甾體激素殘留［J］.色譜，2012，30(10):991-1001.

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［7］歐洲共同體委員會.2002/657/EC號決議［S］.2002.

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