薄永恒，高迎春，陳 玲，陸慶泉，張呈軍，魏秀麗

(1.山東省獸藥質量檢驗所，濟南250022;2.山東省畜產品質量安全監(jiān)測與風險評估重點實驗室，濟南250022)

氯霉素由Ehrlich等在1947年從委內瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取獲得，現(xiàn)在基本使用化學合成法大量生產，已廣泛用于動物各種傳染性疾病的治療，對各類家禽、家畜、水產品及蜂蜜制品各種傳染性疾病的控制和治療起重要作用。由于氯霉素還可與人體線粒體的70S結合，因而也可抑制人體線粒體的蛋白合成，對人體產生毒性。氯霉素在動物性食品中的殘留對人類健康可以造成嚴重危害，主要表現(xiàn)在以下幾個方面［1］:(1)引起骨髓造血機能紊亂;(2)對早產兒和新生兒產生蓄積毒性;(3)引起胃腸道癥狀及口部炎癥;(4)其他不良反應可引起視神經炎、視力障礙、多發(fā)性神經炎、神經性耳聾以及嚴重失眠，有時發(fā)生中毒性精神病。基于以上危害，世界各國都對其做出了嚴格規(guī)定，嚴禁氯霉素在食源性動物上使用，歐盟規(guī)定動物源食品中氯霉素殘留的最低要求執(zhí)行限(MRPL)為0.3 μg/kg。我國農業(yè)部235號公告中把氯霉素列為禁用藥物［2］。

資料顯示［3－4］，氯霉素在動物的肌肉組織中主要以原形藥代謝，而在肝臟、腎臟多以氯霉素(CAP)、氯霉素葡萄糖酸苷(CAPG)和Hyocroxyam－酰胺醇類(HAP)及葡萄糖酸苷結合物等形式代謝。雖然已有相關氯霉素殘留檢測的國家標準以及其他行業(yè)標準，但由于農業(yè)行業(yè)標準的781號公告－2－2006的檢測動物組織項目不足，特別是基于氯霉素在肝臟、腎臟代謝規(guī)律的以上新研究發(fā)現(xiàn)，本項目組根據(jù)農業(yè)部農業(yè)行業(yè)標準制定與修訂［(2013)91］的要求制定了氯霉素殘留在動物肝臟、腎臟的LC－MS/MS檢測方法，檢測方法快速、準確，可以滿足大批量樣品高靈敏測定，以期為食品安全檢測提供可靠的確證檢測方法。

1 材料和方法

1.1 儀器 Acquity UPLC－Quattro Premier XETM質譜聯(lián)用儀，Waters公司;Acquity UPLC BEH C18色譜柱(500mg/3cc)，Waters公司;AE260電子天平，Mettler Toledo公司;SIR4漩渦混合器，IKA公司;HY－4調速多用振蕩器，臺式高速冷凍離心機(貝克曼公司)。

1.2 試劑 氯霉素對照品:含量≥98%(Dr.Ehrenstorfer公司);氯霉素－D5對照品:含量≥98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司);β －葡萄糖醛酸苷酶，德國默克;甲醇、乙酸乙酯、正己烷為色譜純(Fisher公司);氨水為分析純;乙酸鈉為分析純;實驗用水均為超純水。

1.3 標準溶液配制

1.3.1 氯霉素標準儲備液 稱取10 mg氯霉素對照品，用甲醇溶解定容至100 mL，溶液濃度為100 μg/mL，－20 ℃保存，有效期1年。

1.3.2 氯霉素－D5標準儲備液 稱取10 mg氯霉素－D5對照品，用甲醇溶解定容至100 mL，溶液濃度為100 μg/mL，－20℃以下保存，有效期1年。

1.3.3 標準工作液 用流動相稀釋適量儲備液，氯霉素濃度為 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL 的系列標準溶液，其中內標氘代氯霉素濃度為5 ng/mL。

1.4 實驗方法

1.4.1 UPLC－MS/MS 分析條件［5］Acquity UPLC BEH C18色譜柱，流動相A相為甲醇，B相為水，梯度洗脫條件:0～3.5 min，10%A線性變化至90%;3.5～ 4.5 min，90%A線性變化至10%;4.5 ～6 min，維持 10%A。流速為 0.3 mL/min，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。

電離電壓為3.1 kV;源溫為110℃;霧化溫度為400℃;錐孔氣流速為50 L/h;霧化氣流速為650 L/h;多反應監(jiān)測(MRM)模式采集。確定各母離子大小的氯霉素與內標的掃描圖如圖1所示。氯霉素的定性、定量離子對及內標氘代氯霉素離子對、離子源、錐孔電壓和碰撞能量如表1所示。

圖1 氯霉素與內標的掃描圖

表1 氯霉素特征離子參考質譜條件

1.4.2 樣品前處理

1.4.2.1 提取 準確稱取(5±0.5)g均質樣品，加入 20 mL 乙酸鈉緩沖液(10 mmol/L)，300 μL β－葡萄糖醛酸苷酶，于37℃溫育過夜17 h。酶解樣品中加入250 μL氯霉素－D5標準工作液，加入15 mL乙酸乙酯，充分渦旋混勻，中速水平震蕩10 min，7000 r/min離心5 min，取上層有機層，旋蒸近干。依次加入正己烷、水各4.0 mL，充分渦旋，40℃水浴中靜置5 min分層，取水層備用。

1.4.2.2 凈化 取 C18固相萃取柱5 mL甲醇、5 mL水分別預洗，取備用液過柱，棄去流出液，用5 mL 20%甲醇水洗滌，抽干，5 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，取上清液于50℃下氮氣吹干，加1 mL 20%甲醇水溶液溶解，過0.22 μm微孔濾膜，上機測試。

1.4.3 標準曲線的繪制 準確量取氯霉素和氯霉素－D5的標準工作液適量，用流動相稀釋，配制成氯霉素濃度為 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL，氯霉素－D5作為內標濃度為5 ng/mL，供液相色譜－串聯(lián)質譜測定，以標準溶液中被測組分峰面積與氯霉素－D5峰面積的比值為縱坐標，標準溶液中相應氯霉素濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數(shù)。

1.4.4 靈敏度 在空白牛、羊、豬、雞的肝臟、腎臟勻漿組織中分別添加氯霉素及氯霉素－D5標準溶液，分別制成0.1、0.2 μg/kg 的2 個空白添加樣品，其中內標氘代氯霉素濃度為1 μg/kg，按確定的提取凈化方法處理后，經UPLC－MS/MS檢測，觀察氯霉素色譜峰信噪比和對應的藥物濃度，確定其檢測限和定量限。

1.4.5 準確度與精密度 采用標準添加法，在牛、羊、豬、雞的肝臟、腎臟的勻漿組織中添加3個不同濃度的氯霉素及氯霉素－D5進行回收率試驗。各濃度進行5個樣品平行試驗，重復3次，求批內、批間相對標準偏差。

2 結果

2.1 標準曲線 氯霉素濃度在0.5～10.0 ng/mL范圍內，色譜峰面積有良好的線性關系，標準曲線見圖2。

圖2 氯霉素溶液的標準曲線

2.2 方法靈敏度 牛、羊、豬、雞的肝臟、腎臟的勻漿組織按上述方法進行處理，氯霉素添加濃度為0.1 μg/kg 時，信噪比(S/N)均 ＞3，確定為方法的檢測限，氯霉素添加濃度為0.2 μg/kg時，信噪比(S/N)均＞10，確定為方法的最低定量限。其中豬肝空白組織中添加0.2 μg/kg氯霉素及相應的空白組織的離子色譜圖，見圖3～圖4。氯霉素標準品溶液色譜見圖5。

圖3 豬肝空白試樣離子質量色譜圖

圖4 豬肝空白添加氯霉素離子質量色譜圖(0.2 μg/kg)

圖5 氯霉素標準溶液離子質量色譜圖(1 ng/mL)

2.3 方法準確度與精密度 各空白組織中在0.2、0.4、2 μg/kg 3 個不同添加濃度的氯霉素，其中內標為1 μg/kg，進行添加回收率試驗，回收率為70% ～120%;本方法批內相對標準偏差≤15%，批間相對標準偏差≤20%，準確度和精密度均能滿足有關法規(guī)的要求。其中豬肝中添加氯霉素的實驗結果見表2。

表2 各組織中添加氯霉素的批內平均回收率、批內相對標準偏差及批間相對標準偏差

3 討論與小結

3.1 樣品前處理條件的優(yōu)化 1994年Heitzman通過飼喂實驗發(fā)現(xiàn)氯霉素在動物體內的代謝消除存在很大差異，其代謝的共同點是肌肉組織中原形藥物最多，在牛和禽的肝臟組織中藥物的主要殘留形式是氯霉素(CAP)、氯霉素葡萄糖酸苷(CAPG)和Hyocroxyam－phenicol(HAP)，豬的腎臟中多以葡萄糖酸苷結合物的形式存在［3］。因此，在提取肝臟、腎臟組織中的氯霉素時，考慮其葡萄糖酸苷結合物的存在，因此樣品加入了β－葡萄糖醛酸苷酶，以酶解其形成原形藥再做提取，從而使得檢測結果更加接近真值。提取時采取乙酸乙酯提取，20%甲醇水飽和正己烷液液萃取凈化的肉樣提取方法，也可以提取到氯霉素，但是由于肝腎細胞組織提取裂解后，很多細胞成分不能有效去除，而降低了色譜柱的柱效，減少了有效使用時間，甚至直接堵塞色譜柱，因此使用C18固相萃取柱凈化是必要的。

3.2 色譜方法的優(yōu)化 實驗中使用了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm × 50 mm)色譜柱，分別使用了甲醇/水和乙腈/水系統(tǒng)作為流動相進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)甲醇/水液能得到良好的峰形，且具有更高的質譜響應，與已有報道的乙腈/水為流動相不同［6－8］。同時為了使基質中雜質在色譜柱中充分洗脫，在5 min的洗脫基礎上，增加至6 min一個樣品。

3.3 質譜方法優(yōu)化 通過單針將一定濃度的氯霉素及氯霉素－D5注入離子源，在負離子檢測方式下進行一級質譜分析、二級質譜分析，得到母離子及子離子信息，然后對錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，對離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量等進行優(yōu)化，使樣液中的離子化效率達到最佳。

本方法檢測豬、牛、羊、雞肝臟、腎臟試料中殘留的氯霉素含量，用β－葡萄糖醛酸苷酶酶解后乙酸乙酯提取，C18固相萃取柱凈化，液相色譜－串聯(lián)質譜負離子模式測定，內標法定量，成功建立了動物性食品的肝臟、腎臟組織中氯霉素的殘留檢測方法。氯霉素的檢測限為 0.1 μg/kg，最低定量限為0.2 μg/kg。整個實驗過程簡單、快速，回收率較高，適合樣品動物性食品中氯霉素殘留的定量檢測。

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