趙 武，劉 偉，孟 菲，陸榮寶，銀慧慧，覃振華，姜源明，甘渝群，孫建華*

(1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530001;2.廣西動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，南寧530001;3.廣西康普動(dòng)物保健品股份有限公司，南寧530001)

黃藤素(Fibriuretinin)是我國自行研制的純天然植物藥，臨床用于治療生殖系統(tǒng)炎癥、外科感染、菌痢、腸炎、呼吸道以及泌尿道感染、眼結(jié)膜炎等［1］。天然黃藤素主要從防已科植物黃藤的干燥藤莖中提取獲得，是一種季胺鹽異喹啉類生物堿，主要成分為巴馬汀(Palmatine)鹽酸鹽;鹽酸巴馬汀易溶于熱水，但冷水中溶解度低，其水溶液制劑在低溫環(huán)境易結(jié)晶析出，物理性狀不穩(wěn)定，不利于注射液、口服溶液劑等制劑的開發(fā)利用。為此，經(jīng)過溶解性試驗(yàn)和制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)，篩選出性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低、對(duì)動(dòng)物機(jī)體無危害的煙酸作助劑，并成功制備3%煙酸黃藤素注射液。黃藤素以植物提取物形式入藥，其藥理毒理基礎(chǔ)研究相對(duì)比較薄弱，系統(tǒng)性研究鮮有資料報(bào)道;相反，時(shí)有黃藤素致過敏性休克、藥疹、腹痛、大便潛血、唾液腺腫大、肺水腫等臨床不良反應(yīng)報(bào)道［2］。本研究通過溶血性試驗(yàn)、肌肉刺激性試驗(yàn)、口服和腹腔注射急性毒性試驗(yàn)對(duì)煙酸黃藤素注射液安全性和毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步進(jìn)行臨床試驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供藥理毒理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 煙酸黃藤素注射液由廣西獸醫(yī)研究所獸藥新技術(shù)研發(fā)中心與廣西康普動(dòng)物保健品股份有限公司聯(lián)合制備，批號(hào)20130806，含量規(guī)格3%，性狀為黃色澄明液體。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大耳白兔2只，雌雄各1 只，體重2.0 ～2.5 kg;昆明種小鼠，4 周齡，130 只，雌雄各半，體重18～22 g，其中30只用于預(yù)實(shí)驗(yàn)，100只用于正式試驗(yàn)，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK桂2009－0002。

1.2 方法

1.2.1 溶血與凝集試驗(yàn)［3］

1.2.1.1 紅細(xì)胞混懸液制備 取兔耳靜脈血約20 mL，置于裝有玻璃珠的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)，輕輕搖動(dòng)玻璃瓶約20 min，除去纖維蛋白，取出血液，加等量生理鹽水混勻，紗布過濾，濾液1500 r/min離心10 min，吸去上清液;沉淀的紅細(xì)胞再加生理鹽水清洗，離心。如此重復(fù)3～5次至上清液無色透明。最后一次3000 r/min離心沉淀10 min，按紅細(xì)胞容積加生理鹽水配成2%的紅細(xì)胞混懸液。

1.2.1.2 測(cè)定方法 取干燥無菌試管7只，1至6號(hào)試管分別加入煙酸黃藤素注射液 0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0 mL，生理鹽水 2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 mL;7號(hào)試管加入蒸餾水2.5 mL，搖勻，然后向1至7號(hào)試管分別加入2.5 mL 2%紅細(xì)胞混懸液，搖勻，置于 37 ℃恒溫箱中，分別于 0.5、1、2、3 h 觀察是否有溶血及凝血現(xiàn)象發(fā)生。

1.2.2 肌肉刺激性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［3］方法，新西蘭兔2只，剪去兩腿外側(cè)被毛，2.5%碘酊和75%的乙醇消毒后，每只兔左、右腿股四頭肌內(nèi)分別注射3%煙酸黃藤素注射液1 mL，注射后48 h處死動(dòng)物，解剖取出兩側(cè)股四頭肌，縱向切開，觀察注射局部刺激反應(yīng)，取局部組織標(biāo)本進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。按以下標(biāo)準(zhǔn)換算相應(yīng)的反應(yīng)級(jí):0級(jí)為無明顯變化;1級(jí)為輕度充血，范圍在0.5 cm×1.0 cm以下;2級(jí)為中度充血，范圍在0.5 cm×1.0 cm以上;3級(jí)為重度充血，伴有肌肉變性;4級(jí)為出現(xiàn)壞死，有褐色變性;5級(jí)為出現(xiàn)廣泛性壞死。計(jì)算出4塊股四頭肌反應(yīng)級(jí)的總和。

1.2.3 小鼠急性毒性試驗(yàn)［4］

1.2.3.1 口服試驗(yàn) 50只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只(雌雄各5只)，正常給水及廣西醫(yī)科大學(xué)提供的小鼠混合飼料，觀察3 d，飲水、采食、精神狀態(tài)均正常。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，灌服4200 mg/kg，小鼠100%死亡，灌服 2000 mg/kg，小鼠0%死亡。按相鄰組間距比值1.2計(jì)算5組給藥劑量為:2000、2400、2880、3456、4147 mg/kg;按劑量用灌胃針灌服。觀察小鼠飲水、采食和行為變化，以及死亡情況，剖檢觀察死亡小鼠臟器病理變化。連續(xù)觀察7 d，并作記錄。

1.2.3.2 腹腔注射試驗(yàn) 50只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只(雌雄各5只)，正常給水及廣西醫(yī)科大學(xué)提供的小鼠混合飼料，觀察3 d，飲水、采食、精神狀態(tài)均正常。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，腹腔注射劑量300 mg/kg，小鼠100%死亡，腹腔注射劑量75 mg/kg，小鼠0%死亡。按相鄰組間距比值1.4 計(jì)算 5 組給藥劑量為:75、105、147、206、288 mg/kg;按劑量腹腔注射。觀察小鼠飲水、采食和行為變化，以及死亡情況，剖檢觀察死亡小鼠臟器病理變化。連續(xù)觀察7 d，并作記錄。

2 結(jié)果

2.1 溶血與凝集試驗(yàn)結(jié)果 在觀察時(shí)間內(nèi)，1～6號(hào)管未見溶血和紅細(xì)胞凝聚現(xiàn)象，第7管溶液呈紅色透明，有溶血現(xiàn)象。結(jié)果表明煙酸黃藤素注射液0.1～0.5 mL在3 h內(nèi)對(duì)兔紅細(xì)胞不產(chǎn)生溶血和凝聚作用。

2.2 肌肉刺激性試驗(yàn)結(jié)果 肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，1號(hào)兔左側(cè)股四頭肌輕度充血，其范圍小于0.5 cm×1 cm，右側(cè)股四頭肌無明顯變化;2號(hào)兔左右兩側(cè)股四頭肌均輕度充血，其范圍小于0.5 cm×1 cm。根據(jù)刺激反應(yīng)中反應(yīng)級(jí)的分值計(jì)為分3，結(jié)果見表1。鏡檢見肌纖維組織橫紋清晰，結(jié)構(gòu)基本完整，部分區(qū)域見局灶性出血，未見炎細(xì)胞浸潤以及肌纖維的變性壞死。

表1 肌肉刺激反應(yīng)分級(jí)結(jié)果

2.3 小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 口服試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)食管灌入煙酸黃藤素注射液30 min后，部分小鼠開始出現(xiàn)藥物反應(yīng)，第3組至第5組小鼠活躍程度不如第1組，采食量比第1組明顯減少，但飲水量增加，部分昆明小鼠表現(xiàn)出興奮不安，痙攣，縮成一團(tuán)，呼吸困難，昏迷，4 h后開始出現(xiàn)死亡。到第7 d，存活小鼠采食、飲水正常，活動(dòng)自如。死亡小鼠剖檢，外形未見異常，剖檢發(fā)現(xiàn)，肺臟輕微充血，支氣管淤血，粘液較多;胃粘膜充血、水腫，腸系膜充血;脾臟腫大，邊緣鈍圓，肝臟表面呈暗紫紅色，切面呈暗紅色，質(zhì)地變軟;心臟充盈，輕微水腫。用改良寇氏法計(jì)算得出LD50為 2866 mg/kg，LD5095% 可信限為 2455～3346 mg/kg(表2)。

表2 小鼠口服急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 腹腔注射試驗(yàn)結(jié)果 各組小鼠按劑量注射煙酸黃藤素注射液后，部分小鼠10 min開始出現(xiàn)藥物反應(yīng)，第3組至第5組小鼠活躍程度不如第1組，飲水量增加，部分小鼠躬腰縮背，卷縮起來，活動(dòng)減少，痙攣，呼吸困難，昏迷，約30 min后第5組開始出現(xiàn)死亡。到第7 d，存活小鼠采食、飲水正常，活動(dòng)自如。死亡小鼠剖檢，外形未見異常，剖檢發(fā)現(xiàn)，肺臟輕微充血，支氣管淤血，粘液較多;腸系膜充血;脾臟腫大，邊緣鈍圓，肝臟表面呈暗紫紅色，切面呈暗紅色，質(zhì)地變軟;心臟充盈，輕微水腫;輸尿管有白色尿酸鹽沉積。用改良寇氏法計(jì)算得出LD50為 153 mg/kg，LD5095%可信限為 117～199 mg/kg(表3)。

表3 小鼠腹腔注射急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

為了制備有效藥物濃度更高、物理性狀穩(wěn)定性更好、臨床使用更為方便的黃藤素注射液，本研究篩選性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低、對(duì)動(dòng)物機(jī)體無危害的煙酸作助溶劑，成功制備3%煙酸黃藤素注射液。本試驗(yàn)對(duì)煙酸黃藤素注射液的溶血性、肌肉刺激性和急性毒性進(jìn)行了試驗(yàn)。在溶血與凝集試驗(yàn)中，煙酸黃藤素注射液0.1～0.5 mL在3 h內(nèi)對(duì)兔紅細(xì)胞不產(chǎn)生溶血和凝聚作用，說明煙酸黃藤素注射液符合注射液溶血與凝集試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，與李群力等［5］發(fā)現(xiàn)黃藤素葡萄糖注射液在體外對(duì)家兔紅細(xì)胞不產(chǎn)生溶血及凝集作用的研究結(jié)果相一致。在肌肉刺激性試驗(yàn)中，2只試驗(yàn)兔4塊股四頭肌反應(yīng)級(jí)總和為3，按照2只試驗(yàn)兔4塊股四頭肌反應(yīng)級(jí)之和小于10時(shí)，則認(rèn)為供試品的局部刺激試驗(yàn)符合規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)判斷，3%煙酸黃藤素注射液局部刺激反應(yīng)輕微，肌肉刺激試驗(yàn)符合規(guī)定。在小鼠口服和腹腔注射急性毒性試驗(yàn)中，按照Karber法計(jì)算出LD50分別為2866 mg/kg、153 mg/kg;楊榮等［6］研究結(jié)果表明，黃藤素注射液Beagle犬靜脈給藥近似致死劑量接近50 mg/kg，本試驗(yàn)煙酸黃藤素注射液腹腔注射小鼠近似致死劑量接近75 mg/kg，考慮靜脈注射和腹腔注射給藥途徑的差異，說明煙酸黃藤素注射液與黃藤素注射液比較毒性未明顯增強(qiáng)。按照LD50在1 mg/kg以下者為極毒，1～50 mg/kg為劇毒，50～500 mg/kg為中等毒，500～5000 mg/kg為低毒，5001～15000 mg/kg為實(shí)際無毒，＞15000 mg/kg為無毒標(biāo)準(zhǔn)判斷，煙酸黃藤素口服給藥屬低毒性藥物，注射給藥屬中等毒性藥物。以上試驗(yàn)對(duì)煙酸黃藤素注射液安全性和毒性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步進(jìn)行臨床治療試驗(yàn)提供了藥理毒理學(xué)基本依據(jù)。

黃藤素是我國自行研制的純天然植物藥，1977年首次收載于《中華人民共和國藥典》［7］，現(xiàn)收載于《中華人民共和國藥典》2010年版一部“植物油脂和提取物”部分［4］，《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品、中藥卷)第一冊(cè)》也收載了獸用黃藤素注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［8］，黃藤素在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)臨床均具有應(yīng)用基礎(chǔ)。但是，黃藤素以植物提取物形式入藥，其藥理毒理基礎(chǔ)研究相對(duì)比較薄弱，系統(tǒng)性研究鮮有資料報(bào)道;相反，時(shí)有黃藤素致過敏性休克、藥疹、腹痛、大便潛血、唾液腺腫大、肺水腫等臨床不良反應(yīng)報(bào)道［2］。因此，在開發(fā)黃藤素相關(guān)制劑的同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)黃藤素藥理毒理學(xué)基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用提供更為全面的科學(xué)依據(jù)。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2010年版一部［S］.

［2］楊小良，謝麗莎，龔志強(qiáng).黃藤素的研究綜述［J］.中國醫(yī)藥指南，2009，7(17):42－44.

［3］國家食品藥品監(jiān)督管理局.［Z］GPT4－1.中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則［S］.2005.

［4］農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心.獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編(2006－2011年)［S］.2013.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2012:84－87.

［5］李群力，陳 菲.黃藤素葡萄糖注射液安全性實(shí)驗(yàn)研究［J］.中草藥，2007，38:252－253.

［6］楊 榮，陸 瑛，張 玲，等.黃藤素注射液Beagle犬靜脈給藥毒性觀察［J］.四川生理科學(xué)雜志，2005，27(1):48.

［7］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典1997年版一部［S］.

［8］中國獸藥典委員會(huì).獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品、中藥卷)第一冊(cè)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2013:41.