王 梓，孔令聰，高 鐸，劉樹明，馬紅霞，2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春130118)

氟喹諾酮類藥物作為廣譜抗菌藥自1962年投入臨床使用至今已有50余年歷史，已成為臨床中最為常用的抗生素之一。氟喹諾酮類藥物屬于濃度依賴型抗生素，致病菌如果長期處于其亞抑菌濃度時極易產(chǎn)生突變成為耐藥菌［1－3］。作為氟喹諾酮類藥物的主要耐藥機制之一，質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥(Plasmid－mediated quinolone resistance，PMQR)具有傳播速度快、基因亞型較多等特點，且其攜帶的耐藥基因可對細(xì)菌染色體上氟喹諾酮類藥物耐藥基因進(jìn)行靶位修飾，使靶位突變頻率增加［4－5］，嚴(yán)重影響氟喹諾酮類藥物的使用壽命。故探索質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥機制對于控制耐藥基因的快速傳播，減少耐藥菌的危害具有重要意義。

1 質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥基因的發(fā)現(xiàn)

現(xiàn)有研究表明，質(zhì)粒攜帶的氟喹諾酮類藥物耐藥基因主要有3種，分別為包含有多種亞型的qnr基因、介導(dǎo)主動外排的基因、發(fā)生點突變的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。其中，Martínez－Martínez等在研究肺炎克雷伯菌天然攜帶的pMG252質(zhì)粒時，首次發(fā)現(xiàn)了五肽重復(fù)序列qnr基因［6］，隨后陸續(xù)報道了多種qnr基因亞型［7－9］。此后，在對 qnr基因的作用機制進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，qnr基因既能介導(dǎo)氟喹諾酮類藥物耐藥，還可以通過增加gyrA、parC等靶位基因的突變頻率，使細(xì)菌耐藥能力增強［10］。各qnr基因亞型概況如表1所示。隨后，Haru Kato等［11］在日本確證了由質(zhì)粒介導(dǎo)的外排基因QepA，在該試驗中發(fā)現(xiàn)，QepA基因能夠介導(dǎo)細(xì)菌對諾氟沙星的外排作用，且其外排可以被外排泵抑制劑CCCP(carbony cyanide m－chlorophenyl－h(huán)ydrazone)抑制，為質(zhì)子依賴型外排泵。由此推測，QepA基因所介導(dǎo)的外排作用可能是質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥的重要途徑之一。G.A.Jacoby等在研究中又發(fā)現(xiàn)了另一種PMQR基因aac(6')－Ib－cr，該基因由氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因發(fā)生Trp102Arg和Asp179Tyr點突變獲得，其可介導(dǎo)大腸桿菌對環(huán)丙沙星的抗性［12］，該基因自發(fā)現(xiàn)以來在氟喹諾酮耐藥菌株中傳播迅速，在三類PMQR基因中檢出率較高［13－15］。

表1 qnr基因各亞型概況

2 質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥基因的分布

現(xiàn)有流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多種PMQR基因常共存于同一耐藥質(zhì)粒中。Kees Veldman等在歐洲13個國家分離出的沙門氏菌和大腸桿菌中分別檢測出 qnrA1、qnrB、qnrD、aac(6’)－Ib－cr基因，其中 qnrD基因為在歐洲出現(xiàn)的首次報道［16］;Ya－Hong Liu等在廣東省分離的大腸桿菌中分別檢測出 qnrB、qnrS、aac(6’)－ Ib－cr、QepA 等基因［17］;Patricia Andres等在南美洲分離的百余株腸桿菌中也擴增出 qnrB、qnrS、aac(6’)－Ib－cr等氟喹諾酮耐藥基因［18］。由于單獨的PMQR基因通常只介導(dǎo)低水平耐藥，故耐藥菌常通過多種耐藥基因的共同作用以形成高水平耐藥性。近年來，由于動物運輸、耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移等因素，PMQR基因已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛分布，伴隨著PMQR基因突變的不斷發(fā)生，未來將會有更多的PMQR基因耐藥亞型不斷出現(xiàn)。同時，攜帶氟喹諾酮類藥物耐藥基因的質(zhì)粒也可能攜帶其他多種耐藥基因，報道最多的為與廣譜β－內(nèi)酰胺酶基因共存。通過多種類耐藥基因在同一質(zhì)粒上的整合即可形成多重耐藥質(zhì)粒，而且多重耐藥質(zhì)粒的分布范圍也在逐步擴大，在沙門氏菌、克雷伯菌、變形桿菌中均發(fā)現(xiàn)多重耐藥質(zhì)粒的存在［19－20］，但質(zhì)粒攜帶的多種耐藥基因的表達(dá)水平是否可以相互影響，還需進(jìn)一步研究驗證。

3 質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥機制

3.1 PMQR基因的傳播機制 攜帶PMQR基因的耐藥質(zhì)?？焖賯鞑ナ悄壳胺Z酮類藥物耐藥性增強的重要因素之一。質(zhì)粒上攜帶的PMQR基因可以直接通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移實現(xiàn)基因的相互傳遞，也可利用質(zhì)粒中整合子、轉(zhuǎn)座子的傳遞實現(xiàn)PMQR基因的快速傳播。Humberto Barrios等將攜帶β－內(nèi)酰胺耐藥基因(CTX－M－15)和多個氟喹諾酮耐藥基因(qnrA1、qnrB2、aac(6’)－Ib－cr)的質(zhì)粒在不同溫度下進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移實驗:結(jié)果在受體菌中發(fā)現(xiàn)了兩個不同的質(zhì)粒，其中大小為300 kb的質(zhì)粒pSZ300中攜帶了 CTX －M －15、qnrA1、aac(6’)－Ib－cr基因，并產(chǎn)生氟喹諾酮類藥物抗性;而大小為50 kb的質(zhì)粒pSZ50中僅發(fā)現(xiàn)有qnrA1基因，測序結(jié)果顯示 pSZ50包含于質(zhì)粒 pSZ300中［21］。此試驗證明，質(zhì)粒在水平傳播過程中能發(fā)生重組，從而導(dǎo)致耐藥質(zhì)粒多樣化。Be'la Kocsis等首次發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒ST147中qnrS1可與窄譜β－內(nèi)酰胺酶LAP－2基因共存，并進(jìn)一步通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗獲得了一個97 kb質(zhì)粒，其同時攜帶有供體菌上的上述兩種耐藥基因，進(jìn)而使受體菌對頭孢他啶、環(huán)丙沙星等藥物的MIC值均提高了2倍以上［22］。如果細(xì)菌的染色體上存在耐藥基因，則質(zhì)粒介導(dǎo)的PMQR機制可促使細(xì)菌產(chǎn)生更高水平的耐藥，給臨床治療帶來困難。通過類似多藥耐藥轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的橫向傳播，將會使不同菌屬細(xì)菌間形成復(fù)雜的高水平多重耐藥機制。而設(shè)法限制耐藥質(zhì)粒的快速傳播，將成為減緩細(xì)菌對氟喹諾酮類抗菌藥的主要途徑之一。

3.2 PMQR基因表達(dá)的調(diào)控機制 目前有關(guān)QepA、aac(6’)－Ib－cr基因的研究多集中于流行病學(xué)調(diào)查中耐藥基因的種類檢測，關(guān)于影響PMQR基因調(diào)節(jié)和表達(dá)的報道還較少。最近的研究證實，細(xì)菌的SOS反應(yīng)是調(diào)節(jié)qnr基因表達(dá)量的重要因素之一。SOS反應(yīng)是細(xì)菌在DNA受到持續(xù)損傷壓力下產(chǎn)生的一種自救反應(yīng)，可以由LexA、RecA等基因調(diào)控，能夠增加細(xì)菌耐藥基因的突變頻率。近年來已有學(xué)者相繼報道了多種qnr基因可以在細(xì)菌發(fā)生SOS反應(yīng)時發(fā)生表達(dá)量的改變。其中，David C.Hooper等通過改變溫度增加細(xì)菌的生存壓力使其產(chǎn)生SOS反應(yīng)的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受試菌的qnrB基因表達(dá)量增加，進(jìn)而對環(huán)丙沙星的耐受能力明顯增強，對qnrB基因進(jìn)一步基因環(huán)境研究表明，qnrB基因的上游序列中存在的LexA基因可對細(xì)菌DNA的持續(xù)損傷壓力產(chǎn)生應(yīng)答，從而引發(fā)細(xì)菌的SOS反應(yīng)提高qnrB的表達(dá)量［23］。隨后，A.Briales等發(fā)現(xiàn)qnrD基因以及一個新型染色體攜帶的Smaqnr基因都擁有相似的LexA結(jié)構(gòu)，可以在不同濃度的環(huán)丙沙星、莫西沙星等藥物作用下將上述qnr基因表達(dá)量提高 1.5 ～16 倍［23－24］。上述實驗結(jié)果證明，通過溫度改變、藥物作用等方式增加細(xì)菌生存壓力時，可以選擇性的誘發(fā)細(xì)菌的SOS反應(yīng)，繼而使含有LexA結(jié)構(gòu)的qnr基因發(fā)生表達(dá)量的改變，使細(xì)菌產(chǎn)生更強的耐藥性。目前，有關(guān)三種PMQR基因表達(dá)機制的深入探索還有待進(jìn)一步的研究。

3.3 PMQR基因的作用機制 在三種PMQR基因中，QepA的作用機制主要通過主動外排系統(tǒng)減少藥物在細(xì)菌菌體內(nèi)的聚集，其外排泵結(jié)構(gòu)與MFS外排泵超家族極為相似，為質(zhì)子依賴型外排泵，細(xì)菌可依靠其外排作用提高對諾氟沙星、環(huán)丙沙星等藥物的MIC值2倍以上，并能在其他耐藥基因共同作用下使細(xì)菌產(chǎn)生更強耐藥性［11］。aac(6’)－Ib－cr的作用機制為，當(dāng) aac(6’)－Ib基因的102位色氨酸突變?yōu)榻M氨酸及179位天冬氨酸突變?yōu)槔野彼峁餐l(fā)生時，即可將環(huán)丙沙星與細(xì)菌結(jié)合位點乙?；瑥亩蛊涫?xì)菌的抑制作用。細(xì)菌存在aac(6’)－Ib－cr基因的同時，還可增加染色體上相關(guān)耐藥基因的突變頻率，從而增強細(xì)菌的耐藥性。而當(dāng)QepA基因與aac(6’)－Ib－cr基因共存與耐藥質(zhì)粒上時，可使細(xì)菌對環(huán)丙沙星的耐藥性較qnrA基因單獨作用時提高4倍以上，達(dá)到藥物敏感性折點［25］。而目前有關(guān)qnr基因作用機制尚未完全闡明，其機制的探索主要參考其他五肽重復(fù)蛋白(pentapeptide repeat－containing proteins)，如染色體上同樣可以介導(dǎo)氟喹諾酮類藥物耐藥的McbG和MfpA蛋白。編碼McbG和MfpA的基因與qnr基因具有19.6%和18.9%的同源性，其主要耐藥機制是通過保護DNA促旋酶和抑制藥物對DNA的超螺旋作用［26－27］。近年來新發(fā)現(xiàn)了兩種新型染色體攜帶的 qnr－like基因，即 EfsQnr和 Smaqnr。其作用機制與MfpA較相似，可以抑制ATP依賴型DNA超螺旋，從而產(chǎn)生對氟喹諾酮類藥物的耐藥性;而Smaqnr基因與qnrB1基因具有高達(dá)80%的同源性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的同源性最高的qnr－like基因［28－29］。通過對這些染色體上攜帶的qnr－like基因作用機制的深入研究，可以逐步探索質(zhì)粒攜帶qnr基因的作用機制及遺傳環(huán)境，為質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥機制的進(jìn)一步闡明及在根本上限制細(xì)菌的耐藥性奠定基礎(chǔ)。

4 展望

隨著質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥機制研究的不斷深入，人們對細(xì)菌氟喹諾酮類耐藥性的產(chǎn)生及傳播有了更全面的認(rèn)識。但同時，細(xì)菌的耐藥性也日趨復(fù)雜，近期研究顯示，質(zhì)粒介導(dǎo)的 aac(6’)－Ib－cr基因在染色體中也被發(fā)現(xiàn)［25］，這說明細(xì)菌正通過改變自身的耐藥途徑來增加人們控制其耐藥性的難度。在未來的研究中，可能還會有更多耐藥基因在染色體和質(zhì)粒中相互整合，形成復(fù)雜的耐藥環(huán)境。因此，在規(guī)范臨床合理用藥的同時，利用現(xiàn)有細(xì)菌耐藥機制研究的深層成果，通過基因敲除、反義RNA等生物學(xué)方法控制耐藥質(zhì)粒的快速傳播、抑制耐藥基因的表達(dá)，將是未來控制細(xì)菌耐藥性的有效途徑之一。同時，對于細(xì)菌耐藥機制的研究也應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，闡明耐藥基因在染色體與質(zhì)粒中的整合途徑及影響方式等未知耐藥機制。相信經(jīng)過廣大科研工作者的不斷努力，一定能夠有效控制細(xì)菌耐藥性，為人類的生命安全提供保障。

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