岳耀敬等

摘要：抑制素A和抑制素B是由不同抑制素/激活素β亞基（βA、βB）和結構相似的α亞基組成的同源二聚體，即抑制素A （αβA）、抑制素B（αβB）。利用生物信息學技術對抑制素α亞基（INHα）進行三級結構建模，并利用ClustalW和SPDV軟件比較INHα與其他轉化生長因子β（TGF-β）超結構家族成員在結構和序列方面的異同。結果表明，激活素（ACT）、骨形成蛋白7（BMP7）、BMP9與type Ⅱ受體結合面的核心氨基酸在INH α 中不僅在多處發(fā)生了突變，而且在空間上也發(fā)生了很大位移，因此如果INH α同時與type Ⅱ受體在與激活素、BMP7、BMP9的相同位置結合，那么INH α會比激活素與激活素受體ActRⅡ、ActRⅡB的親和力低。ACT A中幾個參與活化素受體樣激酶4（ALK4）相互作用的氨基酸在INH α中發(fā)生了突變，ACT A α螺旋中極性氨基酸在INH α 中被非極性氨基酸所替代，且α 螺旋在空間上發(fā)生了很大位移，INH α 不與ALK4結合。可見，抑制素信號傳導機制為：抑制素與Betaglycan高親和力結合并與ActR Ⅱ、ActR ⅡB、BMPR Ⅱ形成復合物，但不與ALK4結合，因此將它們與激活素和BMP隔離。

關鍵詞：抑制素α亞基；3D結構模擬；TGF-β；結構特征

中圖分類號： Q75文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0032-05

收稿日期：2013-12-11

基金項目：甘肅省青年自然科學基金（編號：1308RJYA037）。

作者簡介：岳耀敬（1980—），男，山東聊城人，博士研究生，助理研究員，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。Tel：（0931）2115173；E-mail：yueyaojing@caas.cn。抑制素（inhbin，INH）、激活素（activin，ACT）、骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）、TGF-β2、TGF-β3 同屬TGF-β超家族的生長和分化因子，這個多肽激素家族控制著許多發(fā)育和生物學進程，并且對正常的生長過程和不同組織的功能極其重要[1]。激活素是由抑制素/激活素的β亞基[激活素A（βAβA）、激活素AB （βAβB）、激活素 B（βBβB）]構成的二聚體蛋白，而抑制素是抑制素/激活素β亞基與結構相似的α亞基的同源二聚體[抑制素A（αβA）、抑制素B（αβB）][2]。抑制素和激活素合成大量前體蛋白，并通過細胞內對巰基連接的二聚體進行切割，釋放出成熟的具有完整生物活性的羧基端蛋白。激活素和抑制素在控制生殖功能上的重要性已經被許多研究和臨床觀察所證實[1]。目前已經了解到，抑制素、激活素和卵泡抑制素通過對腦垂體和性腺軸的作用來控制生殖功能[1]。除了激活素和抑制素，其他TGF-β超家族成員包括TGF-β、BMPs的亞型、GDFs以及MIS也控制著性腺軸的發(fā)育及其功能[3]。

目前TGF-β超家族中一些成員的受體已經確定，發(fā)現(xiàn)幾乎所有這些受體在細胞外、跨膜和細胞內區(qū)域均有相似結構，即絲氨酸/蘇氨酸磷酸激酶結構域。TGF-β家族的配體通過與2類細胞表面受體（typeⅠ、Ⅱ ）相互作用而啟始信號傳導[2]。目前由TGF-β超家族成員Activin A（PDB ∶1nys）[4]、Activin A（PDB ∶2arv）[5]、BMP2 （PDB ∶1rew）[6]、BMP7（PDB ∶1lx5）[7]、BMP9/GDF2（PDB ∶1zkz）[8]與受體相互作用的蛋白質結構已經被鑒定，然而尚未見關于抑制素結構的報道，并且抑制素受體尚未確定，因此抑制素信號傳導機制也尚未確定。

為了研究抑制素信號傳導機制，本研究嘗試應用生物信息學方法對抑制素α亞基（inhbinα，INHα）進行結構建模，并通過比較INHα與TGF-β超家族成員Activin A（PDB ∶1nys）、Activin A（PDB ∶2arv）、BMP2（PDB ∶1rew）、BMP7（PDB ∶1lx5）、BMP9/GDF2（PDB ∶1zkz）的結構差異，分析INHα結構與功能的關系。

1材料與方法

1.1氨基酸參考序列

INHα成熟肽序列有豬INHα：（Sus scrofa） P04087、人INHα：（Homo sapiens）NP_002182.1、綿羊INHα：（Ovis aries）ABS82446.1、牛INHα：（Bos taurus）NP_776519.2、馬INHα：（Equus caballus） NP_001075379.1、狗INHα：（Canis familiaris） XP_5456601、小鼠INHα：（Mus musculus）NP_034694.3、雞INHα：（Gallus gallus）NP_001026428.1。TGFβ 超結構家族氨基酸參考序列有Activin A（PDB ∶2arv）、BMP2（PDB ∶1rew）、BMP7 （PDB ∶1lx5）、BMP9/GDF2（PDB ∶1zkz）、TGFβ1（PDB ∶2tgi）、 Activin A、Activin B、Activin C、Activin E、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMP10、TGFβ1、TGFβ2、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDF9B、GDF10、GDF11、GDF15、Nodal、MIH/AMH，均引自人類基因組網站（www.ensembl.org）。

1.2試驗方法

INHα序列同源性搜索應用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST程序；氨基酸一級結構的比較借助DNAstar軟件包ClustalW、ClustalV多序列比較程序，對參考序列進行多序列比較分析和進化樹分析；INHα氨基酸二級結構應用PredictProtein軟件[9]進行預測分析。應用I-TASSER軟件[10]對豬INHα的3級結構進行模擬。用蛋白質結構預測評價軟件SAVS （http：//nihserver.mbi.ucla.edu/SAVS/）、ProSa（Protein Structure Analysis，http：//www.came.sbg.ac.at）對預測的三級結構進行質量評估。應用Dali（http：//www.ebi.ac.uk/dali/）對所預測的INHα進行結構相似性搜索。應用SPDV軟件比較分析INHα、Activin A（PDB∶1nys）、Activin A（PDB∶2arv）、BMP2 （PDB∶1rew）、BMP7 （PDB∶1lx5）、BMP9/GDF2（PDB∶1zkz）的結構特征。

2結果與分析

2.1INHα一級氨基酸序列分析

抑制素前體被翻譯出來后，在細胞內要經過一系列蛋白質成熟加工過程才能成為具有生物活性的INHα。INHα前體在各種哺乳動物中的差異較大，但是成熟INHα的同源性卻較好。豬抑制素前體序列由364個氨基酸組成，成熟肽序列只有134個氨基酸。應用BLAST程序在GenBank蛋白質數(shù)據(jù)庫中進行同源搜索發(fā)現(xiàn)，INHα（1～27）為抑制素所特有，尚未發(fā)現(xiàn)其他蛋白質與其同源。利用DNAstar軟件包中的ClustalW多序列比較程序對INHα成熟肽序列中的氨基酸進行比較，發(fā)現(xiàn)INHα（Sus scrofa） P04087與INHα（Homo sapiens）NP_002182.1、INHα（Ovis aries）ABS82446.1、INHα（Bos taurus）NP_776519.2、INHα（Equus caballus） NP_001075379.1、INHα（Canis familiaris） XP_5456601、INHα（Mus musculus）NP_034694.3、INHα（Gallus gallus）NP_001026428.1氨基酸序列的一致性分別為83.6%、90.3%、88.8%、88.1%、811%、89.6%、86.5%。其中形成TGF-β超結構家族結構特征 “Cys結”的7個Cys在位置上十分保守。對序列進行比較可知，在不同哺乳動物INHα中，Pro3、Val26、Ala 34、Pro68、Asp70、Pro74、Ser87、Pro105是保守氨基酸，變異位點主要集中在第64～90位氨基酸之間。豬INHα與其他哺乳動物成熟INHα序列的一致性都在83%以上（83.6%～903%），說明INHα在種間比較保守；與雞的成熟INHα序列一致性稍低，為71.7%，且在67～75、82～85、87～90位之間發(fā)生了氨基酸缺失（圖1）。

利用DNAstar軟件包中的Clustal V多序列比較程序進行人INHα與TGFβ超結構家族其他成員的氨基酸序列比較，結果表明，豬INHα與人ACT A （Activin A，ACT A）、ACT B、ACT C、ACT E、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMP9/GDF2、BMP10、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDF9B、GDF10、GDF11、GDF15、TGFβ1、TGFβ2、MIH/AMH、Nodal氨基酸序列的一致性分別為167%、21.9%、18.4%、21.1%、23.3%、21.6%、245%、227%、22.7%、22.7%、22.5%、24.0%、20.7%、20.7%、206%、24.8%、19.5%、22.5%、19.5%、20.2%、20.4%、200%、19.3%、20.7%、23.6%、18.1%、16.7%，16.7%、168%?？傮w來看，豬INHα與TGFβ超結構家族其他成員的氨基酸序列一致性并不高，只有20%左右；然而從序列比較中可知，形成TGFβ超結構家族結構特征 “Cys結”的7個Cys在位置上卻十分保守；從序列比較中還可看出，在不同TGFβ超結構家族成員中，除了Cys外，Arg32、Leu35、Phe39、Gly43、Trp44、Trp47、Ile48、Pre51、Tyr58、Gly61、Pro100也比較保守，但其他氨基酸則有較大變異。

2.2INHα 氨基酸的二級結構

PROSITE motif search分析表明，在INHα 第36～39位有糖基化位點Asn-Ile-Ser-Phe。應用PredictProtein對INHα蛋白質二級結構進行預測，由圖2的二級結構看出，豬INHα的α-螺旋有1個77～84區(qū)段；β-折疊有6個，分別是32～41、47～49、55～57、106～112、117～122、126～1128位的氨基酸殘基；其余區(qū)段為柔性區(qū)域，PredictProtein預測為柔性區(qū)域的為1～12、19～30、42～45、51～53、59～76、87～106、113～116、124～125位的氨基酸殘基。

2.3INHα 氨基酸的三級結構模擬

將序列INHα（Sus scrofa）P04087氨基酸序列提交至自動建模軟件I-TASSER進行蛋白質三級結構建模，然后應用SPDV軟件進行能量最小化優(yōu)化。預測的INHα亞基3級結構模型見圖3。用SAVS對所預測的INHα 結構進行模型質量分評估。SAVS分析拉馬錢德蘭圖的結果表明，在建立的模型中，98%氨基酸殘基的二面角落在允許區(qū)，97%氨基酸殘基的二面角落在最適宜區(qū)域，只有氨基酸殘基Leu5、Asn70、Cys96落在了不允許區(qū)域，84.44%氨基酸3D-1D score大于0.2，INHα三級結構模型多肽鏈總的ProSa能量評分（能量分值為正值表明該區(qū)域結構不合理，存在錯誤肽鏈折疊結構，分值為負值則表明此區(qū)域屬于合理的結構）平均得分是 -4.01，表明INHα模型的立體構象比較合理，符合立體化學、 二面角分布和能量的要求。

INHα的氨基酸三級結構（圖3）中分布著2個α螺旋區(qū)域：40～42、75～86區(qū)域，以及3個反向平行的β片層結構（31～39、52～60）、（101～104、127～130）、（109～112、116～120）氨基酸殘基區(qū)域，其他為具有柔性的β轉角和無規(guī)則卷曲區(qū)域：1～30、43～51、61～75、87～100、105～108、113～115、121～123、131～134氨基酸殘基區(qū)域；這同PredictProtein預測的二級結構基本一致。INHα的氨基酸三級結構（圖3）形似一個 “手腕”，INHα的1～30位氨基酸形成“指3”，31～60位氨基酸形成“指2”，61～95位氨基酸形成凹形的“掌”，96～134位氨基酸形成“指2”。在INHα三級結構（圖4）中，有3對由CysS30～Cys96、Cys59～Cys131、Cys63～Cys133形成的二硫鍵，構成INHα的“Cys結”。未參與二硫鍵形成的的Cys95 在空間結構上位于INHα三級結構的疏水核心，很可能參與INHα與β亞基間二硫鍵的形成。疏水氨基酸主要分布在INHα 三級結構的內部，構成疏水的內核，親水氨基酸主要分布在四周，負電荷也分布在四周，有利于抑制素α亞基掌狀結構的穩(wěn)定。

2.4INHα 三級結構特點與比較

將通過Dali軟件預測的三級結構在數(shù)據(jù)庫中進行結構相似性搜索，發(fā)現(xiàn)INHα 3級模型與人BMP9（PDB ID：1ZKZ）結構相似，它們同屬于TGFβ超結構家族成員。

他們的擬合的RMSD（root-mean-square deviation，RMSD）為1.16 S.D.（standard deviationnm，S.D.）。雖然它們的氨基酸序列一致性只有20.6%，但具有TGFβ超結構家族結構特征的7個Cys在位置上十分保守（圖2）。從圖4可看出，抑制素α亞基的3對二硫鍵與BMP9的Cys8～Cys74、Cys37～Cys107、Cys41～Cys109形成的3對二硫鍵完全一致，形成“Cys結”，而與INHα Cys95處在同一位置的BMP9 Cys73也未參與二硫鍵的形成（圖4），說明抑制素α亞基的模型是合理的。

INHα 的三級結構模型與人其他TGFβ超結構家族成員：Activin A（PDB ∶2arv）、BMP7 （PDB ∶1lx5）、BMP2（PDB ∶1rew）、BMP9/GDF2（PDB ∶1zkz）、TGFβ1（PDB ∶2tgi）結構相比較發(fā)現(xiàn)，它們擬合的RMSD分別為1.36 S.D.、1.58 S.D.、156 S.D.、1.03 S.D.、1.61 S.D.。由圖5可以看出，INHα三級結構模型與人其他TGFβ超結構家族成員都具有2個指的“掌”狀結構和3對二硫鍵形成“Cys結”；然而INHα除具有以上結構特征外，還具有另外的“指”——指3。從圖

5還可以看出，INHα的三級結構模型與人其他TGFβ超結構家族成員的結構差異主要表現(xiàn)在INHα Ser1～His27、Gly61～Cys95、Arg104～Pro124氨基酸區(qū)段，即INHα“指3”“掌”和“指2”的第3對β片層結構（109～112、116～120）處。

TGF-β家族的配體通過與2類細胞表面受體（typeⅠ、Ⅱ）相互作用而啟始信號傳導過程。TGF-β同typeⅠ、Ⅱ結合后形似1個漢堡包[5]。INH和ACT具有共同的β亞基，ACT是由 INH/ACT的β亞基同源二聚體蛋白構成的，而抑制素是由INH/ACTβ亞基和結構相似的α亞基的異源二聚體構成[2]。然而研究發(fā)現(xiàn)，抑制素與激活素受體ActRⅡ、ActRⅡB的親和力不到激活素的1/10[11]。將INHα同TGFβ超結構家族成員ACT A、BMP7、BMP9與type Ⅱ受體結合的結構擬合后比較結果可知：ACT A通過氨基酸Phe17、Ile30、Ala31、Pro32、Arg87、Pro88、Ser90、Leu92、Try94、Ile100、Lys102、Asp104形成的疏水區(qū)域與ActRⅡ、ActRⅡB相互作用[4]；ACT A、BMP7、BMP9中幾個參與ActRⅡ、ActRⅡB相互作用的關鍵氨基酸[5-8]在INHα 中發(fā)生了突變，例如ACT Ala31（BMP7 Ala 58，BMP9 Ala 28）被His50取代，BMP7 Ser 113（BMP9 Ser 83）被 Arg107取代，ACT Leu92（BMP7 Leu115，BMP9 Leu85）被Arg109或Thr111所取代，另外十分保守的ACT基序Lys102-X-Asp104在INHα中被改變?yōu)門yr-X-Thr；INHα與ACT相比在空間上發(fā)生了很大的位移，如ACT Pro32-INHα Pro51之間的RMSD為1.96 S.D.，ACT Arg87-INHα Arg104之間的RMSD為0.96 S.D.，ACT Ser90-INHαArg107之間的RMSD為1.50 S.D.，ACT Ley92-INHα Arg109之間的RMSD為1.69 S.D.，ACT Tyr94-INHα Thr111之間的RMSD為354 S.D.，ACT Ile100-INHα Phe118之間的RMSD為5.78 S.D.，ACT Lys102-INHα Tyr120之間的RMSD為3.97 S.D.，ACT Asp104-INHα Thr122之間的RMSD為2.52 S.D.；ACT、BMP7、BMP9與type Ⅱ受體結合面的核心氨基酸在INHα中不僅多處發(fā)生了突變，而且在空間上發(fā)生了很大位移。如果INHα與type Ⅱ受體與激活素、BMP7、BMP9在相同的位置結合，那么INHα 比激活素與ActRⅡ、ActRⅡB的親和力低。

ACT A通過α 螺旋（Ser60～Ser 72）及Met90、Ile105、Met 108形成的凹槽與ALK4結合[12]。激活素中幾個參與ALK4相互作用的氨基酸在INHα中發(fā)生了突變，例如激活素α螺旋中的Thr61、Asn64、His65、Arg67、Arg69、His71等極性氨基酸在INHα中被Val75、Val78、Pro79、Thr81、Val83、Pro85等非極性氨基酸所替代，且α螺旋在空間上發(fā)生了很大位移，如ACT A Ser72與 INHα Ieu86之間的RMSD為13.57 S.D.，由此推測 INHα 可能不與ALK4結合。BMP2、BMP9通過“指1”的頂部和α 螺旋前的Loop區(qū)及α 螺旋與BMPR-IA結合[6，8]。BMP2中幾個參與BMPR-IA相互作用的保守的關鍵氨基酸在INHα中發(fā)生了突變，例如BMP2 Phe549（BMP9 Phe43）被Ieu65取代，BMP2 Leu551、Ala552、Asp553被Thr67、Ieu68、Pro69取代，BMP2 Ile562、Ieu566被Ala78、Pro82所取代，BMP2 Tyr603被Val123所取代，然而α螺旋在空間上與BMP2、BMP9、INHα之間并未像ACT 那樣發(fā)生了很大位移，它們之間的RMSD<1 S.D.，由此推測INHα 可能與 BMPR-IA 結合。

3結論與討論

抑制素對激活素信號傳導的拮抗作用依賴與激活素type Ⅱ受體（ActR Ⅱ或ActR ⅡB）的競爭性結合[11，13-15]。Gray等研究證明，激活素、抑制素與ActRⅡ受體具有同樣的結合位點[16]。本研究結果表明，激活素、BMP7、BMP9、type Ⅱ受體結合面的核心氨基酸在INHα中不僅多處發(fā)生了突變，而且在空間上發(fā)生了很大位移，因此如果INHα與type Ⅱ受體與激活素、BMP7、BMP9在相同的位置結合，那么INHα會比激活素與ActRⅡ、ActRⅡB的親和力低，因此抑制素通過INHβ亞基與受體ActRⅡB結合[11]。親和標記表明，抑制素同重組和內生性的ActRⅡ和betaglycan形成三元復合物，但不與ALK4結合[17]，這與本研究結果一致。雖然BMP2、BMP9中幾個參與BMPR-IA相互作用的關鍵保守氨基酸在INHα中發(fā)生了突變，但INHα α螺旋在空間上與BMP2、BMP9、INHα之間并未像ACT 那樣發(fā)生了很大位移，至于INHα 能否與BMPR-IA結合還需進一步試驗來驗證。

抑制素同ActR Ⅱ受體的親和力不及激活素的10%，在一些組織和細胞中，抑制素并不能拮抗激活素，因此需要另外的成分來輔助其完成生物功能。最近研究證明，betaglycan（TGF-β type Ⅲ）是抑制素的共受體[17]。Betaglycan與抑制素具有很高的親和力，在ActRⅡ和betaglycan共表達的細胞中，這種親和力會增加30倍以上。親和標記表明，抑制素同重組和內生性的ActRⅡ和betaglycan形成三元復合物，但不與ALK4結合[17]。Betaglycan的蛋白和mRNA在大鼠的腦、垂體、性腺中表達，說明在這些器官中betaglycan對抑制素的功能具有調節(jié)作用[18-19]。Betaglycan同人INHα的Tyr50、Val108、Arg109、Thr 110、Thr 111、Ser 112、Ser 117、Phe 118、Lys 119 和Thy 120結合位點在胞外區(qū)的第500～700位氨基酸[20-21]；INHα上betaglycan的結合位點與INHα上潛在ActRⅡB結合位點重疊；INHβ與INHα通過二硫鍵形成異二聚體，抑制素的信號傳導可能通過INHβ與受體ActRⅡB結合，INHα與betaglycan結合促進了INHβ與ActRⅡB的親和力。

抑制素信號傳導機制為：抑制素和betaglycan高親和力地結合，與ActR Ⅱ，ActR ⅡB形成復合物，但不與ALK4結合[17]，因此將它們同激活素隔離。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腎上腺皮質細胞系中，抑制素對激活素和BMP有不同的拮抗效果。本研究發(fā)現(xiàn)，INHα 中與ActRⅡB和betaglycan的結合位點為“指2”的第3對β片層結構（109～112、116～120）和“指1”的隆起處（His50～Ile55）。筆者通過INHα 的抗原表位進行預測發(fā)現(xiàn)，INHα的B細胞線性抗原表位有1～30、43～51、61～75、87～100和105～125位的氨基酸殘基。然而最近的抑制素基因疫苗的研究主要以INHα 1～32作為抗原，為了提高抑制素基因疫苗的免疫原性，還應引入INHα 105～125作為候選抗原。

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