田 輝，于凱忠，毛爭春，金成華，潘海彬，楊 曦，黃曉燕，沈韋羽*

(1寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院胸外科，寧波 315041;2寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者，E-mail:nblhlswy@163.com)

近年來肺癌的發(fā)病率和死亡率迅速上升，躍居腫瘤第一位，其治療也成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。其中以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為靶點(diǎn)的靶向治療方法以其較好的特異性和較小的副作用逐漸被腫瘤學(xué)術(shù)界和廣大患者所重視。

EGFR是一種受體型酪氨酸激酶，在許多腫瘤中過表達(dá)和/或發(fā)生突變，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)控制腫瘤生長，并與新生血管生成、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等有密切的關(guān)系［1］。以EGFR為靶點(diǎn)的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)的藥物(如厄羅替尼和吉非替尼)在非小細(xì)胞肺癌，特別是在肺腺癌的治療中顯示出很好的抗腫瘤的療效，但并非所有使用該藥的肺癌患者都能受益［2］。近期的研究發(fā)現(xiàn)EGFR的基因的19和21外顯子的突變與TKIs的療效密切相關(guān)，不同外顯子的突變將導(dǎo)致蛋白的構(gòu)象變化，改變和增強(qiáng)蛋白的活性，增強(qiáng)對TKIs的敏感性［3］。本研究檢測了314例中國大陸非小細(xì)胞肺癌患者的EGFR突變情況，并與部分國外報道的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，同時分析EGFR突變與其臨床特征間的關(guān)系，旨在為篩選最合適的病人進(jìn)行有針對性的靶向治療提供依據(jù)，避免不合理用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

收集寧波李惠利醫(yī)院2012－06～2013－11間胸外科手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本314例，其中男性199例，女性115例;年齡34－82歲，中位數(shù)61歲;有吸煙史的病人191例;根據(jù)ICC 1997年新的修訂標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，Ⅰ期89例，Ⅱ期87例，Ⅲ期116例，Ⅳ期22例;所有患者術(shù)前均未接受過放化療和EGFR－TKI治療等抗腫瘤治療。所有標(biāo)本均用裝有RNAlater(QIAGEN Catalog no.76106)的凍存管保存于4℃，并于2 d內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2 方法

采用PCR擴(kuò)增和測序法分析肺癌患者手術(shù)組織中EGFR外顯子19，21突變情況。手術(shù)組織DNA提取采用PROMEGA Wizard?基因組DNA純化試劑盒并按說明書步驟進(jìn)行。取15 ml離心管一只，加入600μl核裂解液，10－20 mg組織，使用小型勻漿機(jī)勻漿10 s。65℃孵育該裂解物15－30 min。待樣品達(dá)到室溫后，加入200μl蛋白沉淀液并使用渦旋振蕩器高速劇烈振蕩20 s。置于冰上冷卻5 min。(13 000－16 000)×g離心4 min，可形成白色致密的蛋白沉淀。在一個干凈的1.5 ml小離心管中，加入600μl室溫異丙醇。移取上步中含DNA的上清至此小離心管。輕輕顛倒混勻溶液，直至白色線狀DNA形成塊狀沉淀。(13 000－16 000)×g室溫離心1 min。可見白色小塊狀DNA沉淀。小心棄去上清。加入600μl室溫70%乙醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次清洗DNA沉淀，(13 000－16 000)×g室溫離心1 min。使用加樣槍頭小心吸走乙醇溶液。將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥10－15 min。向離心管中加入100μl DNA Rehydration Solution，65℃孵育30 min溶解DNA。取2μl測定濃度和純度，其余儲存于－80℃。通過PCR方法擴(kuò)增EGFR基因外顯子19和21，exon19引物序列分別為上游:5’－GCAATATCAGCCTTAGG－3’，下游:5’－TCCAGACATGAGAAAAGG－3’;exon21上游:5’－TTCTTTGGATCAGTAGTCAC－3’，下游 5’－CATGTGTTAAACAATACAGC－3’。具體操作方法參照試劑盒(PROMEGA GoTaq? GreenMaster Mix)說明進(jìn)行。最后在ABI3730測序儀上機(jī)測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件對率的數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變特點(diǎn)

在314例肺癌標(biāo)本中，共檢測到EGFR基因突變120例(38.2%)。其中外顯子19檢測到EGFR基因突變51例(42.5%);外顯子21檢測到EGFR基因突變69例(57.5%);未見外顯子19和外顯子21的雙突變。其中，外顯子19的突變以del E746－A750型為主，有35例(29.1%)，而del L747－A750型突變有11例(9.1%)，其他突變類型5例;在本組病例中，69例外顯子21的L858R型突變有65例(54.1%)，L861Q 型的突變有4 例(3.3%，見表1)。

2.2 EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系

在這314例病例中，男性患者的EGFR突變率為21.1%(42/199)，明顯低于女性患者(67.8%，78/115，P＜0.05)。無吸煙史者EGFR基因突變發(fā)生率為 58.5%(72/123)，有吸煙史者為 25.1%(48/191)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。TNM分期Ⅰ期EGFR基因突變發(fā)生率為39.2%，Ⅱ期為 35.6%，Ⅲ期為 38.8%，Ⅳ期為40.9%，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 EGFR基因突變特點(diǎn)Table 1 Distribution of EGFR gene mutation

表2 EGFR基因突變與臨床特征關(guān)系 例(%)Table 2 Correlation between EGFR gene mutation and clinical features cases(%)

3 討論

Lynch 等［3］和 Paez等［4］報道了酪氨酸激酶抑制劑EGFR－TKI對非小細(xì)胞肺癌的療效與EGFR外顯子的突變明顯相關(guān)。EGFR基因共28個外顯子，其中編碼酪氨酸激酶區(qū)的是第18－21外顯子。對EGFR基因突變的數(shù)據(jù)分析表明，盡管突變部位分散在整個酪氨酸激酶編碼區(qū)，但89%的突變集中在第19外顯子的缺失和第21外顯子的L858R點(diǎn)突變［5］，且突變多發(fā)生于于腺癌、非吸煙和女性肺癌患者［6］。美國非小細(xì)胞肺癌的患者中只有約10%有EGFR的基因突變，但是在亞洲人中，約30%的非小細(xì)胞肺癌患者有EGFR的基因突變［7，8］。本研究發(fā)現(xiàn)，在中國的 NSCLC 患者中，38.2%(120/314)的患者存在EGFR外顯子19或/和21的突變，EGFR的突變狀態(tài)與患者的性別、吸煙狀況有關(guān);女性、非吸煙者中EGFR外顯子19、21的突變率顯著高于其他患者，是選用TKIs治療的優(yōu)勢人群，這與國外文獻(xiàn)報道相符［3］。

以往的研究［3，4］表明，EGFR 外顯子 21 的L858R和外顯子19的缺失突變占突變的絕大多數(shù)，被認(rèn)為是活化性突變。外顯子21的L858R單核苷酸的替換突變靠近保守的Asp-Phe-Gly序列，突變使活化頸環(huán)(activation-loop)的穩(wěn)定性增加。而外顯子19的缺失突變靠近alpha-C-helix(羧基端α螺旋結(jié)構(gòu)域)，而后者控制著與ATP結(jié)合囊的角度，突變使ATP 結(jié)合囊變窄［9］。Lynch 等［3］認(rèn)為這兩種突變增強(qiáng)了EGFR與ATP或其競爭性抑制劑吉非替尼的相互作用。因此，有EGFR基因突變的患者表現(xiàn)出對吉非替尼更好的治療反應(yīng)。Mitsudomi等［10］注意到兩種突變在使用TKIs后的反應(yīng)有差異:在使用厄洛替尼或吉非替尼后，EGFR外顯子19缺失突變的患者有效率高于具有L858R突變的患者，且生存時間較L858R突變患者長。

綜上所述，由于NSCLC中EGFR基因突變與TKIs治療敏感性顯著相關(guān)，因此在肺癌的個體化治療中應(yīng)檢測EGFR基因的突變，并根據(jù)EGFR突變情況來選擇用藥，以避免患者因使用無效的藥物而承擔(dān)高額的醫(yī)療費(fèi)用和耽誤治療時間。

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